000011　范围

本标准规定了食品中凝固酶阳性的金黄色葡萄球菌（Staphylococcus聽aureus）的检验方法。

本标准第一法适用于食品中凝固酶阳性的金黄色葡萄球菌的定性检验；第二法适用于金黄色葡萄球菌含量较高的食品中凝固酶阳性的金黄色葡萄球菌的计数；第三法适用于金黄色葡萄球菌含量较低而杂菌含量较高的食品中凝固酶阳性的金黄色葡萄球菌的计数。

2聽设备和材料

除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：

2.1聽恒温培养箱：36聽℃±1聽℃。

2.2聽冰箱：2聽℃～5聽℃。

2.3聽恒温水浴箱：37聽℃～65聽℃。

2.4聽天平：感量0.1聽g。

2.5聽均质器。

2.6聽振荡器。

2.7聽无菌吸管：1聽mL（具0.01聽mL聽刻度）、10聽mL（具0.1聽mL聽刻度）或微量移液器及吸头。

2.8聽无菌锥形瓶：容量100聽mL、500聽mL。

2.9聽无菌培养皿：直径90聽mm。

2.10聽L涂布棒。

2.11聽pH聽计或pH聽比色管或精密pH聽试纸。

3聽培养基和试剂

3.1聽7.5聽%氯化钠肉汤：见附录A聽中A.1。

3.2聽血琼脂平板：见附录A聽中A.2。

3.3聽Baird-Parker聽琼脂平板：见附录A聽中A.3。

3.4聽兔血浆纤维蛋白原（RPF）琼脂培养基：见附录A聽中A.4。

3.5聽脑心浸出液肉汤(BHI)聽：见附录A聽中A.5。

3.6聽兔血浆：见附录A聽中A.6。

3.7聽稀释液：磷酸盐缓冲液：见附录A聽中A.7。

3.8聽营养琼脂小斜面：见附录A聽中A.8。

3.9聽革兰氏染色液：见附录A聽中A.9。

3.10聽无菌生理盐水：见附录A聽中A.10。

第一法聽金黄色葡萄球菌定性检验

4聽检验程序

聽

金黄色葡萄球菌定性检验程序见图1。

聽

5聽操作步骤

5.1聽样品的处理

称取25聽g聽样品至盛有225聽mL聽7.5聽%氯化钠肉汤的无菌均质杯内，8000聽r/min～10000聽r/min聽均质1聽min～2聽min，或放入盛有225聽mL聽7.5聽%氯化钠肉汤无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1聽min～2聽min。若样品为液态，吸取25聽mL聽样品至盛有225聽mL聽7.5聽%氯化钠肉汤的无菌锥形瓶(瓶内可预置适当数量的无菌玻璃珠)中，振荡混匀。

5.2聽增菌和分离培养

5.2.1聽增菌

5.2.1.1聽将上述样品匀液于36聽℃±1聽℃培养18聽h～24聽h。金黄色葡萄球菌在7.5%氯化钠肉汤中呈混浊生

长。

5.2.1.2聽将上述培养物，分别划线接种到Baird-Parker聽平板（a法）或RPF平板（b法），培养24聽h。如果菌落不典型，可继续培养至48h观察。

5.2.2聽分离培养

5.2.2.1聽聽a法：金黄色葡萄球菌在Baird-Parker聽平板上呈圆形,表面光滑、凸起、湿润、菌落直径为2聽mm～3聽mm，颜色呈灰黑色至黑色,有光泽,常有浅色(非白色)的边缘,周围绕以不透明圈(沉淀),其外常有-清晰带。当用接种针触及菌落时具有黄油样粘稠感。有时可见到不分解脂肪的菌株,除没有不透明圈和清晰带外,其他外观基本相同。从长期贮存的冷冻或脱水食品中分离的菌落,其黑色常较典型菌落浅些,且外观可能较粗糙,质地较干燥。挑取上述可疑菌落进行鉴定（见5.3.1、5.3.2、5.3.3）。

5.2.2.2聽聽b法：金黄色葡萄球菌在RPF平板上形成黑色、灰色或白色的小菌落，外围有沉淀晕环。挑取上述可疑菌落进行鉴定（见5.3.1、5.3.2）。

5.3聽鉴定

5.3.1聽染色镜检：金黄色葡萄球菌为革兰氏阳性球菌，排列呈葡萄球状，无芽胞，无荚膜，直径约为

0.5聽μm～1聽μm。

5.3.2聽溶血试验：挑取Baird-Parker聽平板或RPF平板上可疑菌落1聽个或以上，分别划线接种到血平板上纯培养，36聽℃±1聽℃，18聽h～24h。

观察菌落溶血情况，金黄色葡萄球菌在血平板上，形成菌落较大，圆形、光滑凸起、湿润、金黄色（有时为白色），菌落周围可见完全透明溶血圈。

5.3.3聽血浆凝固酶试验：挑取Baird-Parker聽平板上可疑菌落1聽个或以上，分别接种到5聽mL聽BHI和营养琼脂小斜面，36聽℃±1聽℃培养18聽h～24聽h。

取新鲜配置兔血浆0.5聽mL，放入小试管中，再加入BHI聽培养物0.2聽mL～0.3聽mL，振荡摇匀，置36

℃±1聽℃温箱或水浴箱内，每半小时观察一次，观察6聽h，如呈现凝固（即将试管倾斜或倒置时，呈现凝

块）或凝固体积大于原体积的一半，被判定为阳性结果。同时以血浆凝固酶试验阳性和阴性葡萄球菌菌

株的肉汤培养物作为对照。也可用商品化的试剂，按说明书操作，进行血浆凝固酶试验。

结果如可疑，挑取营养琼脂小斜面的菌落到5聽mL聽BHI，36聽℃±1聽℃培养18聽h～48聽h，重复试验。

5.4聽葡萄球菌肠毒素的检验（选做）

可疑食物中毒样品或产生葡萄球菌肠毒素的金黄色葡萄球菌菌株的鉴定，应按附录B检测葡萄球菌

肠毒素。

6聽结果与报告

6.1聽结果判定：

6.1.1聽Baird-Parker聽平板（a法）上的可疑菌落符合5.3.1、5.3.2、5.3.3，可判定为金黄色葡萄球菌。

6.1.2聽RPF平板（b法）上可疑菌落符合5.3.1、5.3.2，可判定为金黄色葡萄球菌。

6.2聽结果报告：在25聽g（mL）样品中检出或未检出金黄色葡萄球菌。

聽

第二法聽聽聽金黄色葡萄球菌平板计数法

7聽检验程序

金黄色葡萄球菌平板计数法程序见图2。

聽

8操作步骤

8.1聽聽样品的稀释

8.1.1聽固体和半固体样品：称取25聽g样品置盛有225聽mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质杯内，8000聽r/min～10000聽r/min均质1聽min～2聽min，或置盛有225聽mL稀释液的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1聽min～2聽min，制成1:10的样品匀液。

8.1.2聽液体样品：以无菌吸管吸取25聽mL样品置盛有225聽mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶(瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠)中，充分混匀，制成1:10的样品匀液。

8.1.3聽用1聽mL无菌吸管或微量移液器吸取1:10样品匀液1聽mL，沿管壁缓慢注于盛有9聽mL稀释液的无菌试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面），振摇试管或换用1支1聽mL无菌吸管反复吹打使其混合均匀，制成1:100的样品匀液。

8.1.4聽按8.1.3操作程序，制备10倍系列稀释样品匀液。每递增稀释一次，换用1次1聽mL无菌吸管或吸头。

8.2聽接种、培养

8.2.1聽聽Baird-Parker平板计数法

8.2.1.1聽接种

根据对样品污染状况的估计，选择2个～3个适宜稀释度的样品匀液（液体样品可包括原液），在进行10倍递增稀释时，每个稀释度分别吸取1聽mL样品匀液以0.3聽mL、0.3聽mL、0.4聽mL接种量分别加入三块Baird-Parker平板，然后用无菌L棒涂布整个平板，注意不要触及平板边缘。使用前，如Baird-Parker平板表面有水珠，可放在25聽℃～50聽℃的培养箱里干燥，直到平板表面的水珠消失。

8.2.1.2聽培养

在通常情况下，涂布后，将平板静置10聽min，如样液不易吸收，可将平板放在培养箱36聽℃±1聽℃培养1聽h；等样品匀液吸收后翻转平皿，倒置于培养箱，36聽℃±1聽℃培养，45聽h～48聽h。

8.2.2聽聽RPF平板计数法：

8.2.2.1聽接种

根据对样品污染状况的估计，选择2个～3个适宜稀释度的样品匀液（液体样品可包括原液），在进行10聽倍递增稀释时，吸取1聽mL聽样品匀液于无菌平皿内，每个稀释度做两个平皿。同时，吸取1聽mL聽空白稀释液加入无菌平皿内作空白对照。

8.2.2.2聽培养

及时将15聽mL～20聽mL聽冷却至46聽℃的RPF琼脂培养基（可放置于46聽℃±1聽℃恒温水浴箱中保温）倾注平皿，并转动平皿使其混合均匀。聽待琼脂凝固后，翻转平板，置３６聽℃±１聽℃培养箱，培养２４ｈ～４８ｈ。

8.3典型菌落计数和确认

8.3.1聽金黄色葡萄球菌在Baird-Parker聽平板上呈圆形,表面光滑、凸起、湿润、菌落直径为2聽mm～3聽mm，颜色呈灰黑色至黑色,有光泽,常有浅色(非白色)的边缘,周围绕以不透明圈(沉淀),其外常有-清晰带。当用接种针触及菌落时具有黄油样粘稠感。有时可见到不分解脂肪的菌株,除没有不透明圈和清晰带外,其他外观基本相同。从长期贮存的冷冻或脱水食品中分离的菌落,其黑色常较典型菌落浅些,且外观可能较粗糙,质地较干燥。

8.3.2聽聽金黄色葡萄球菌在RPF平板上形成黑色、灰色或白色的小菌落，外围有沉淀晕环。

8.3.3聽选择有典型的金黄色葡萄球菌菌落的平板，且同一稀释度3聽个平板所有菌落数合计在20聽CFU～200聽CFU聽之间的平板，计数典型菌落数。如果：

a）聽如果只有一个稀释度平板的菌落数在20聽CFU～200聽CFU之间且有典型菌落，计数该稀释度平板

上的典型菌落；

b）聽最低稀释度平板的菌落数小于20聽CFU聽且有典型菌落，计数该稀释度平板上的典型菌落；

c）聽某一稀释度平板的菌落数大于200聽CFU聽且有典型菌落，但下一稀释度平板上没有典型菌落，

应计数该稀释度平板上的典型菌落；

d）聽某一稀释度平板的菌落数大于200聽CFU聽且有典型菌落，且下一稀释度平板上有典型菌落，但

其平板上的菌落数不在20聽CFU～200聽CFU聽之间，应计数该稀释度平板上的典型菌落；

以上按公式（1）计算。

e）聽2聽个连续稀释度的平板菌落数均在20聽CFU～200聽CFU聽之间且有典型菌落，按公式（2）计算。

8.3.4聽从典型菌落中任选5个菌落（小于5个全选），分别按5.3.1、5.3.2做鉴定试验；Baird-Parker聽平板上的典型菌落还要做血浆凝固酶试验。

9聽结果计算

公式（1）：

聽…………………………………………………………………聽（1）

式中：

T——样品中金黄色葡萄球菌菌落数；

A——某一稀释度典型菌落的总数；

B——某一稀释度鉴定为阳性的菌落数；

C——某一稀释度用于鉴定试验的菌落数；

d——稀释因子。

公式（2）：聽………………………（2）

式中：聽

T聽——样品中金黄色葡萄球菌菌落数；

A1——第一稀释度（低稀释倍数）典型菌落的总数；

A2——第二稀释度（高稀释倍数）典型菌落的总数；

B1——第一稀释度（低稀释倍数）鉴定为阳性的菌落数；

B2——第二稀释度（高稀释倍数）鉴定为阳性的菌落数；

C1——第一稀释度（低稀释倍数）用于鉴定试验的菌落数；

C2——第二稀释度（高稀释倍数）用于鉴定试验的菌落数；

1.1——计算系数；

d聽——稀释因子（第一稀释度）。

10聽结果与报告

根据Baird-Parker平板或RPF平板上金黄色葡萄球菌的典型菌落数，按9中公式计算，报告每g（mL）样品中金黄色葡萄球菌数，以CFU/g(mL)表示；如T值为0，则以小于1乘以最低稀释倍数报告。

第三法聽聽金黄色葡萄球菌MPN计数

11检验程序

金黄色葡萄球菌MPN计数程序见图3。

聽

12聽操作步骤

12.1样品的稀释

按8.1进行。

12.2聽聽接种和培养

12.2.1聽根据对样品污染状况的估计，选择3个适宜稀释度的样品匀液（液体样品可包括原液），在进行10倍递增稀释时，每个稀释度分别吸取1聽mL样品匀液接种到7.5聽%氯化钠肉汤管，每个稀释度接种3管，将上述接种物36聽℃±1聽℃培养，18聽h～24聽h。聽

12.2.2聽聽用接种环从有细菌生长的各管中，移取1环，分别接种Baird-Parker平板或RPF平板，36聽℃±1聽℃培养，24聽h～48聽h。

12.3聽聽典型菌落确认

见8.3

13聽结果与报告

根据证实为金黄色葡萄球菌阳性的试管管数，查MPN检索表（见附录C），报告每g(mL)样品中金黄色葡萄球菌的最可能数，以MPN/g（mL）表示。

聽

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