1　范围

本标准规定了食品中致泻大肠埃希氏菌(diarrheagenic聽Escherichia聽coli)的检验方法。

本标准适用于食品中致泻大肠埃希氏菌的检验。

2聽术语和定义、缩略语

2.1聽聽术语和定义

聽聽聽聽下列术语和定义适用于本文件。

2.1.1聽聽致泻大肠埃希氏菌聽聽Diarrheagenic聽Escherichia聽coli

聽聽聽聽一类能引起人体以腹泻症状为主的大肠埃希氏菌，可经过污染食物引起人类发病。常见的致泻大肠埃希氏菌主要包括肠道致病性大肠埃希氏菌、肠道侵袭性大肠埃希氏菌、产肠毒素大肠埃希氏菌、产志贺毒素大肠埃希氏菌（包括肠道出血性大肠埃希氏菌）和肠道集聚性大肠埃希氏菌。

2.1.2聽聽肠道致病性大肠埃希氏菌聽聽Enteropathogenic聽Escherichia聽coli

聽聽聽聽能够引起宿主肠粘膜上皮细胞黏附及擦拭性损伤，且不产生志贺毒素的大肠埃希氏菌。它是发展中国家婴幼儿腹泻的主要病原菌，有高度传染性，严重者可致死。EPEC的致病机制包括局限性粘附、信号传导和紧密粘附。其中，局限性粘附由存在于EAF质粒上的束状菌毛基因bfp介导，位于LEE毒力岛上的III型分泌系统编码基因esc参与信号传导，引起微绒毛结构消失；而紧密粘附由外膜蛋白紧密素介导，紧密素由eae基因编码。

2.1.3聽聽肠道侵袭性大肠埃希氏菌聽Enteroinvasive聽Escherichia聽coli

聽聽聽聽能够侵入肠道上皮细胞而引起痢疾样腹泻的大肠埃希氏菌。该菌不像典型的大肠埃希氏菌，无动力、不发生赖氨酸脱羧反应、不发酵乳糖，生化反应和抗原结构均近似痢疾志贺氏菌。侵入上皮细胞的关键基因是侵袭性质粒上的抗原编码基因及其调控基因，如ipaH基因、ipaR基因（又称为invE基因）。

2.1.4聽聽产肠毒素大肠埃希氏菌聽Enterotoxigenic聽Escherichia聽coli

聽聽聽聽能够分泌热稳定性肠毒素或/和热不稳定性肠毒素的大肠埃希氏菌。热稳定性肠毒素按照来源不同分为猪源热稳定性肠毒素和人源热稳定性肠毒素，编码基因分别为stp（又称为stIa）和sth（又称为stIb）；热不稳定性肠毒素编码基因为lt。两种肠毒素基因在产肠毒素大肠埃希氏菌中可以单独存在，也可以同时存在。该菌可引起婴幼儿和旅游者腹泻，一般呈轻度水样腹泻，也可呈严重的霍乱样症状，低热或不发热。腹泻常为自限性，一般2～3天即自愈。

2.1.5聽聽产志贺毒素大肠埃希氏菌聽Shiga聽toxin-producing聽Escherichia聽coli（肠道出血性大肠埃希氏菌聽Enterohemorrhagic聽Escherichia聽coli）

聽聽聽聽能够分泌志贺毒素、引起宿主肠粘膜上皮细胞黏附及擦拭性损伤的大肠埃希氏菌。志贺毒素的编码基因为stx，志贺毒素分为两种类型，其编码基因分别为stx1和stx2，相互间无免疫交叉反应。stx1和stx2聽在产志贺毒素大肠埃希氏菌中可以单独存在，也可以同时存在。宿主肠粘膜上皮细胞黏附及擦拭性损伤表现为微绒毛结构消失和紧密粘附，分别由esc编码的III型分泌系统和eae编码的紧密素介导。另外，有些产志贺毒素大肠埃希氏菌在临床上引起人类出血性结肠炎（HC）或血性腹泻，并可进一步发展为溶血性尿毒综合征（HUS），这类产志贺毒素大肠埃希氏菌为肠道出血性大肠埃希氏菌。

2.1.6聽聽肠道集聚性大肠埃希氏菌聽Enteroaggregative聽Escherichia聽coli

聽聽聽肠道集聚性大肠埃希氏菌不侵入肠道上皮细胞，但能引起肠道液体蓄积。不产生热稳定性肠毒素或热不稳定性肠毒素，也不产生志贺毒素。唯一特征是能对Hep-2细胞形成集聚性粘附，也称Hep-2细胞粘附性大肠埃希氏菌。

2.2聽聽缩略语

聽聽聽聽下列缩略语适用于本文件。

2.2.1聽聽DEC：致泻大肠埃希氏菌聽聽Diarrheagenic聽Escherichia聽coli

2.2.2聽聽EPEC：肠道致病性大肠埃希氏菌聽聽Enteropathogenic聽Escherichia聽coli

2.2.3聽聽EIEC：肠道侵袭性大肠埃希氏菌聽Enteroinvasive聽Escherichia聽coli

2.2.4聽聽ETEC：产肠毒素大肠埃希氏菌聽Enterotoxigenic聽Escherichia聽coli

2.2.5聽聽STEC：产志贺毒素大肠埃希氏菌聽Shiga聽toxin-producing聽Escherichia聽coli

2.2.6聽聽EHEC：肠道出血性大肠埃希氏菌聽Enterohemorrhagic聽Escherichia聽coli

2.2.7聽聽EAEC：肠道集聚性大肠埃希氏菌聽Enteroaggregative聽Escherichia聽coli

2.2.8聽聽escV：蛋白分泌物调节基因，gene聽encoding聽聽LEE-encoded聽type聽III聽secretion聽system聽factor

2.2.9聽聽eae：紧密素基因，gene聽encoding聽intimin聽for聽Escherichia聽coli聽attaching聽and聽effacing聽

2.2.10聽聽bfpB：束状菌毛B基因，bundle-forming聽pilus聽B；聽

2.2.11聽stx1：志贺毒素Ⅰ基因，Shiga聽toxin聽one聽

2.2.12聽聽stx2：志贺毒素Ⅱ基因，Shiga聽toxin聽two

2.2.13聽聽lt：热不稳定性肠毒素基因，heat-labile聽enterotoxin

2.2.14聽聽st：热稳定性肠毒素基因，heat-stable聽enterotoxin

2.2.15聽聽stp（stIa）：猪源热稳定性肠毒素基因，heat-stable聽enterotoxins聽initially聽discovered聽in聽the聽isolates聽from聽pigs

2.2.16聽聽sth（stIb）：人源热稳定性肠毒素基因，heat-stable聽enterotoxins聽initially聽discovered聽in聽the聽isolates聽from聽human

2.2.17聽聽invE：侵袭性质粒调节基因，invasive聽plasmid聽regulator；

2.2.18聽聽ipaH：侵袭性质粒抗原H基因，invasive聽plasmid聽antigen聽H-gene；

2.2.19聽聽aggR：集聚粘附菌毛调节基因，aggregative聽adhesive聽fimbriae聽regulator；

2.2.20聽聽uidA：β-葡萄糖苷酶基因，β-glucuronidase聽gene；聽

2.2.21聽聽astA：集聚热稳定性毒素A基因，enteroaggregative聽heat-stable聽enterotoxin聽A；

2.2.22聽聽pic：肠定植因子基因，protein聽involved聽in聽intestinal聽colonization；

2.2.23聽聽LEE：肠细胞损伤基因座，Locus聽of聽enterocyte聽effacement

2.2.24聽聽EAF：EPEC黏附因子，EPEC聽adhesive聽factor

3聽聽设备和材料

除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：

a）恒温培养箱：聽36聽℃±1聽℃，42聽℃±1聽℃；

b）冰箱：2聽℃～5聽℃；

c）恒温水浴箱：100℃，50℃±1聽℃；

d)聽电子天平：感量0.1聽g，感量0.01聽g；

e）显微镜：10倍～100倍；

f）均质器；

g）振荡器；

h）无菌吸管：1聽mL（具0.01聽mL刻度），10聽mL（具0.1聽mL刻度）或微量移液器及吸头；

i）无菌均质杯或无菌均质袋：容量聽500聽mL；

j）无菌培养皿：直径90聽mm；

k）pH计或精密pH试纸；

l）微量离心管：1.5聽mL/2.0聽mL；

m）低温高速离心机；

n）全自动微生物生化鉴定系统；

o）PCR仪；

p）水平电泳仪；

q）8联排管和8联排盖（平盖/凸盖）；

r）凝胶成像仪。

4聽聽培养基和试剂

4.1聽营养肉汤：见附录A聽中A.1。

4.2聽肠道菌增菌肉汤：见附录A聽中A.2。

4.3聽麦康凯琼脂（MAC）：见附录A聽中A.3。

4.4伊红美蓝琼脂（EMB）：见附录A聽中A.4。

4.5聽三糖铁（TSI）琼脂：见附录A聽中A.5。

4.6聽蛋白胨水、靛基质试剂：见附录A聽中A.6。

4.7聽半固体琼脂：见附录聽A聽中聽A.7。

4.8聽尿素琼脂（pH聽7.2）：见附录聽A聽中聽A.8。

4.9聽氰化钾聽（KCN）聽培养基：见附录聽A聽中聽A.9。

4.10聽氧化酶试剂：见附录聽A聽中聽A.10。

4.11聽革兰氏染色液：见附录A中A.11。

4.12聽BHI肉汤：见附录A中A.12。

4.13聽福尔马林（含38%～40%甲醛）。

4.14聽生化鉴定试剂盒。

4.15聽致泻大肠埃希氏菌PCR试剂盒。

4.16聽大肠埃希氏菌诊断血清。

5聽检验程序

聽聽聽聽聽致泻大肠埃希氏菌检验程序见图1。

附录A

培养基和试剂

A.1聽营养肉汤

A.1.1聽聽成分

蛋白胨	10.0g
牛肉膏	3.0g
氯化钠	5.0g
蒸馏水	1000mL
pH7.4±0.2

A.1.2聽制法

将以上成分混合加热溶解，冷却至25聽℃左右校正pH至7.4±0.2，分装适当的容器。121聽°C聽灭菌15聽min。

A.1聽肠道菌增菌肉汤

A.1.1聽聽成分

蛋白胨	10.0g
葡萄糖	5.0g
牛胆盐	20.0g
磷酸氢二钠	8.0g
磷酸二氢钾	2.0g
煌绿	0.015g
蒸馏水	1000mL
pH7.2±0.2

A.1.2聽制法

将以上成分混合加热溶解，冷却至25聽℃左右校正pH至7.2±0.2，分装每瓶30聽mL。115聽°C聽灭菌20聽min。

A.3聽麦康凯琼脂（MAC）

A.3.1聽成分

蛋白胨	20.0g
乳糖	10.0g
3号胆盐	1.5g
氯化钠	5.0g
中性红	0.03g
结晶紫	0.001g
琼脂	15.0g
蒸馏水	1000mL

pH7.2±0.2

A.3.2聽制法

将以上成分混合加热溶解，冷却至25聽℃左右校正pH至7.2±0.2，分装。121℃高压灭菌15min。冷却至45聽℃～50聽℃，倾注平板。

注：如不立即使用，在2聽℃~8聽℃条件下可储存二周。

A.4聽伊红美蓝（EMB）琼脂

A.4.1聽成分

蛋白胨	10.0g
乳糖	10.0聽g
磷酸氢二钾（K2HPO4）	2.0g
琼脂	15.0g
2%伊红Y水溶液	20.0mL
0.5%美蓝水溶液	13.0mL
蒸馏水	1000mL

pH7.1±0.2

A.4.2聽制法

在1聽000聽mL蒸馏水中煮沸溶解蛋白胨、磷酸盐和乳糖，加水补足，冷却至25聽℃左右校正pH至7.1±0.2。再加入琼脂，聽121聽℃高压灭菌15聽min。冷至45聽℃～50聽℃，加入2％伊红Y水溶液和0.5％美蓝水溶液，摇匀，倾注平皿。

A.5聽三糖铁琼脂（TSI）

A.5.1聽成分

蛋白胨	20.0聽g
牛肉浸膏	5.0聽g
乳糖	10.0g
蔗糖	10.0聽g
葡萄糖	1.0聽g
硫酸亚铁铵[(NH4)2Fe(SO4)2·6H2O]	0.2聽g
氯化钠	5.0g
硫代硫酸钠	0.2g
酚红	0.025聽g
琼脂	12.0聽g
蒸馏水	1000mL

聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽pH聽7.4±0.2

A.5.2聽制法

除酚红和琼脂外，将其它成分加于400聽mL水中，搅拌均匀，静置约10聽min，加热使完全溶化，聽冷却至25聽℃左右校正pH至聽7.4±0.2。另将琼脂加于600聽mL水中，静置约10聽min，加热使完全溶化。将两溶液混合均匀，加入5%酚红水溶液5聽mL，混匀，分装小号试管，每管约3聽mL。于121聽°C聽灭菌15聽min，制成高层斜面。冷却后呈桔红色。如不立即使用，在2聽℃聽~8聽℃条件下可储存一个月。

A.6聽蛋白胨水、靛基质试剂

A.6.1聽成分

胰蛋白胨	20.0聽g
氯化钠	5.0聽g
蒸馏水	1000mL

聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽pH聽7.4±0.2

A.6.2聽制法

将以上成分混合加热溶解，冷却至25聽℃左右校正pH至7.4±0.2，分装小试管，121聽℃高压灭菌聽15聽min。

注：此试剂在聽2聽℃~8聽℃条件下可储存一个月。

A.6.3聽靛基质试剂

A.6.3.1聽柯凡克试剂：将聽5聽g聽对二甲氨基苯甲醛溶解于聽75聽mL聽戊醇中。然后缓慢加入浓盐酸聽25聽mL。

A.6.3.2聽欧－波试剂：将聽1聽g聽对二甲氨基苯甲醛溶解于聽95聽mL聽95%乙醇内。然后缓慢加入浓盐酸聽20聽mL。

A.6.4聽试验方法

挑取少量培养物接种，在36聽℃±1聽℃培养1聽d～2聽d，必要时可培养4聽d～5聽d。加入柯凡克试剂约0.5聽mL，轻摇试管，阳性者于试剂层呈深红色；或加入欧－波试剂约聽0.5聽mL，沿管壁流下，覆盖于培养液表面，阳性者于液面接触处呈玫瑰红色。

A.7聽半固体琼脂

A.7.1聽成分

蛋白胨	1.0聽g
牛肉膏	0.3聽g
氯化钠	0.5聽g
琼脂	0.3g～0.5g
蒸馏水	100.0mL

pH聽7.4±0.2

A.7.2聽制法

按以上成分配好，加热溶解，冷却至25聽℃左右校正pH至聽7.4聽±聽0.2，分装小试管。121聽℃灭菌聽15聽min，直立凝固备用。

A.8聽尿素琼脂（pH聽7.2）

A.8.1聽成分

蛋白胨	1.0聽g
氯化钠	5.0聽g
葡萄糖	1.0聽g
磷酸二氢钾	2.0聽g
0.4％酚红	3.0聽mL
琼脂	20.0聽g
20%尿素溶液	100.0聽mL
蒸馏水	1聽000聽mL

pH7.2±0.2

A.8.2聽制法

除酚红和尿素外的其他成分加热溶解，冷却至25聽℃左右校正pH至7.2±0.2，加入酚红指示剂，混匀，于121聽℃灭菌15聽min。冷至约55聽℃，加入用0.22聽碌m过滤膜除菌后的20%尿素水溶液100聽mL，混匀，以无菌操作分装灭菌试管，每管约3聽mL～4聽mL，制成斜面后放冰箱备用。

A.8.3聽试验方法

挑取琼脂培养物接种，在聽36聽℃±1聽℃培养聽24聽h，观察结果。尿素酶阳性者由于产碱而使培养基变为红色。

A.9聽氰化钾（KCN）培养基

A.9.1聽成分

蛋白胨	10.0聽g
氯化钠	5.0聽g
磷酸二氢钾	0.225聽g
磷酸氢二钠	5.64聽g
0.5％氰化钾	20.0聽mL
蒸馏水	1聽000聽mL

A.9.2聽制法

将除氰化钾以外的成分加入蒸馏水中，煮沸溶解，分装后聽121聽℃高压灭菌聽15聽min。放在冰箱内使其充分冷却。每聽100聽mL聽培养基加入聽0.5％氰化钾溶液聽2.0聽mL（最后浓度为聽1:10聽000），分装于无菌试管内,每管约聽4聽mL,立刻用无菌橡皮塞塞紧,放在聽4聽℃冰箱内,至少可保存两个月。同时，将不加氰化钾的培养基作为对照培养基,分装试管备用。

A.9.3聽试验方法

将琼脂培养物接种于蛋白胨水内成为稀释菌液，挑取聽1聽环接种于氰化钾（KCN）培养基。并另挑取聽1聽环接种于对照培养基。在聽36聽℃±1聽℃培养聽1聽d～2聽d，观察结果。如有细菌生长即为阳性（不抑制），经聽2聽d聽细菌不生长为阴性（抑制）。

注:氰化钾是剧毒药,使用时应小心，切勿沾染，以免中毒。夏天分装培养基应在冰箱内进行。试验失败的主要原因是封口不严,氰化钾逐渐分解，产生氢氰酸气体逸出，以致药物浓度降低，细菌生长，因而造成假阳性反应。试验时对每一环节都要特别注意。

A.10聽氧化酶试剂

A.10.1聽成分

N,N’-二甲基对苯二胺盐酸盐或 N,N,N’,N’-四甲基对苯二胺盐酸盐	1.0聽g
蒸馏水	100mL

A.10.2聽制法

少量新鲜配制，于冰箱内避光保存，在7d内使用。

A.10.3聽试验方法

用无菌棉拭子取单个菌落，滴加氧化酶试剂，10s内呈现粉红或紫红色即为氧化酶试验阳性，不变色者为氧化酶试验阴性。

A.11聽革兰氏染色液

A.11.1结晶紫染色液

A.11.1.1成分

结晶紫	1.0ｇ
95％乙醇	20.0聽mL
1％草酸铵水溶液	80.0聽mL

A.111.2聽制法

将结晶紫完全溶解于乙醇中，然后与草酸铵溶液混合。

A.11.2革兰氏碘液

A.11.2.1成分

碘	1.0ｇ
碘化钾	2.0ｇ
蒸馏水	300聽mL

A.11.2.2聽制法

将碘与碘化钾先行混合，加入蒸馏水少许充分振摇，待完全溶解后，再加蒸馏水至300mL。

A.11.3聽沙黄复染液

A.7.3.1聽成分

沙黄	0.25ｇ
95％乙醇	10mL
蒸馏水	90mL

A.11.3.2制法

将沙黄溶解于乙醇中，然后用蒸馏水稀释。

A.11.4聽染色法

A.11.4.1聽涂片在火焰上固定，滴加结晶紫染液，染1min，水洗。

A.11.4.2聽滴加革兰氏碘液，作用1min，水洗。

A.11.4.3聽滴加95％乙醇脱色约15s～30s，直至染色液被洗掉，不要过分脱色，水洗。

A.11.4.4聽滴加复染液，复染1min，水洗、待干、镜检。

A.12聽BHI肉汤

A.12.1聽成分

小牛脑浸液	200ｇ
牛心浸液	250ｇ
蛋白胨	10.0ｇ
NaCl	5.0ｇ
葡萄糖	2.0ｇ
磷酸氢二钠（Na2HPO4）	2.5ｇ
蒸馏水	1聽000聽mL

聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽pH聽7.4±0.2

A.12.2聽制法

按以上成分配好，加热溶解，冷却至25聽℃左右校正pH至聽7.4±0.2，分装小试管。121聽℃灭菌聽15聽min。

聽

聽

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