聽聽 聽阪崎肠杆菌(Enterobacter聽sakazakii)，又名黄色阴沟肠杆菌，聽为肠杆菌科肠杆菌属的一个种，1980聽年改名为阪崎肠杆菌[1]。阪崎肠杆菌主要危害婴儿，导致脑膜炎、败血症及小肠结肠坏死等；也有小部分成人感染骨髓炎和菌血症的报道，虽然有抗生素的治疗，但总体死亡率高达80聽%。目前，聽该菌感染源头还不十分清楚，但多数报告表明奶粉是主渠道。

聽聽聽聽奶粉中阪崎肠杆菌的污染问题引起了FAO/WHO及各国的高度重视。FAO/WHO聽于2004聽年5聽月2聽日～5日在日内瓦召开了“婴儿配方奶粉中阪崎肠杆菌和其他微生物”聽研讨会。会议报告将婴儿配方奶粉中病原微生物分成3聽类，聽其中阪崎肠杆菌与肠炎沙门氏菌并列被认为A聽类病原微生物，即该类病原菌在流行病学和微生物学上都有令人信服的证据表明被污染的婴儿奶粉是婴儿患病的传播媒介和传染源。

聽聽聽聽我国于2005聽年8聽月颁布了检验检疫行业标准《奶粉中阪崎肠杆菌检测方法》共分为三个部分，分别规定了分离计数法、普通PCR聽法及实时荧光PCR聽法，供不同条件的实验室选择使用。

1聽材料

1.1聽菌株

阪崎肠杆菌ATCC29544、12868、29004。

1.2聽试剂

肠杆菌增菌肉汤，MLST聽增菌液（每升含有胰酪胨20聽g，氯化钠34.22聽g，乳糖5.0聽g，磷酸氢二钾2.75聽g，磷酸二氢钾2.75聽g，月桂基硫酸钠0.1聽g，聽万古霉素10聽mg，pH7）；聽脑心浸液(bioMérieux)；营养琼脂，显色培养基琼脂（Xα-GlcA），氧化酶试验试剂（bioMérieux）；聽细菌全基因组DNA聽提取试剂盒，引物：5’-GGGTTGTCTGCGAAAGCGAA-3’、5’-GTCTTCGTGCTGCGAGTTTG-3’；PCR聽试剂盒，100聽bp聽DNA聽ladder，琼脂糖，10×loading聽buffer，5×TBE聽（Tris54聽g，0.5聽mol/L聽EDTA聽pH8.0聽20聽mL，硼酸27.5聽g，加蒸馏水至1聽000聽mL）。

1.3聽仪器

离心机（Eppendorf,聽5417R,聽Germany）；聽PCR聽扩增仪（MJ聽Research,聽PTC-200，American）；聽电泳仪(Hoefer,PS3000,聽American)；凝胶成像仪（Bio-Rad,聽T2A,聽Italy）；VITEK聽生化鉴定系统。

2聽方法

2.1聽分离与计数法

聽聽聽聽取样前消毒样品包装的开启处和取样勺。无菌称取样品100聽g聽3聽份，至2聽L聽的样品稀释瓶中，加入900聽mL预热到45聽℃的灭菌蒸馏水，聽振摇使样品充分混匀，36聽℃±1℃培养18聽h～22聽h。移取增菌液10mL聽加入90mLEE肉汤中，36℃±1℃培养18聽h～22聽h。每份增菌液用接种环接种Xα-GlcA聽平板，三区法或四区法划线，以得到单个菌落。将平板置36聽℃±1聽℃培养18聽h～22聽h。观察平板上阪崎肠杆菌的典型形态：蓝绿色菌落，圆形，直径1聽mm～2聽mm。挑取可疑菌落，聽接种营养琼脂36℃±1℃培养18聽h～22聽h，聽进行革兰氏染色为阴性杆菌，氧化酶试验阴性，用VITEK聽生化鉴定系统进行生化鉴定。

2.2聽普通PCR聽检测法

2.2.1聽增菌

聽聽聽聽无菌称取奶粉试样100聽g聽3聽份，聽加到已预热的44聽℃聽900聽mL聽MLST聽中，振摇使样品充分混匀后，聽44聽℃恒温培养22聽h～24聽h。在液面1聽cm聽以下取MLST聽增菌液0.2聽mL聽加到装有5聽mL聽BHI聽的小试管中，混匀，36聽℃±1聽℃恒温水浴4聽h，水面要高于试管中培养基高度。

2.2.2聽模板DNA聽提取

聽聽聽聽取BHI聽增菌液1.5聽mL，10聽000聽r/min聽离心2聽min，尽量倒尽上清液。按细菌基因组DNA聽提取试剂盒操作说明书提取模板DNA，聽所提取的模板DNA聽溶于50聽μLTE聽中。

聽聽聽聽同时用煮沸法提取增菌液DNA。BHI聽增菌液1.5mL，10聽000聽r/min聽离心2聽min，聽倒尽上清液沉淀溶于50聽μLTE聽中，煮沸5聽min，10聽000聽r/min聽离心2聽min，取上清液备用。

聽聽聽聽剩余BHI聽增菌液36聽℃±1聽℃恒温过夜培养，聽以备确证试验使用。

2.2.3聽PCR聽扩增

反应条件：94聽℃预变性5聽min，94聽℃变性30聽s，57聽℃退火30聽s，72聽℃延伸30聽s，聽进行35聽个循环，72聽℃延伸5聽min，4聽℃下保存。反应体系见表1。

2.2.4聽质控

聽聽聽聽检测过程中要设阳性对照、阴性对照和空白对照。分别接种阪崎肠杆菌和金黄色葡萄球菌到10聽mLNB聽中，36聽℃±1聽℃过夜培养，聽各取1.5聽mL聽增菌液，离心，提取DNA聽模板。阪崎肠杆菌DNA聽模板作阳性对照，金黄色葡萄球菌DNA聽模板作阴性对照，空白对照加水1聽μL。

2.2.5聽确证试验

聽聽聽聽阪崎肠杆菌PCR聽扩增产物为282聽bp，如果电泳出现阳性条带，则取恒温培养的相应剩余BHI聽增菌液接种于阪崎肠杆菌显色培基，参照2.1聽分离与计数方法，挑取可疑菌落进行鉴定。

3聽结果与讨论

3.1聽分离计数法与普通PCR聽法检测比较

对50聽份进口原料乳粉分离计数法和普通PCR法同时比对检测，以评价两种方法的符合程度，结果见表2。

聽聽聽 从表2聽中可以看出，两种方法的检验结果完全相符，说明两种方法检验奶粉中阪崎肠杆菌结果均准确、可靠。

聽聽聽聽通过两种方法比较检测，聽虽然检测效果相同，但是比较其检验流程，聽如果样品为阴性结果，PCR聽方法较分离计数法快2聽d；如果检测结果为阳性，PCR聽方法较分离计数法可早1聽d聽得到结果。

聽聽聽聽同时发现同一标准下不同检测方法的增菌步骤不尽相同，而且由于PCR聽方法阳性结果需要分离计数法确认试验，以分离到阳性菌株为最终结果，所以统一增菌步骤，建立一套完整的试验体系，将使试验设计更为严密。

3.2聽DNA聽提取方法比较

聽聽聽聽对50聽份进口原料乳粉进行普通PCR聽法检测时，DNA聽提取同时采用试剂盒、煮沸法两种方法进行。结果显示两种方法对BHI聽增菌液进行DNA聽提取时，试验结果完全相同。分析原因，MLST聽及BHI聽对阪崎肠杆菌增菌效果很好，聽当样品中有阪崎肠杆菌100聽CFU/100聽g检测在阪崎肠杆菌试验中，聽取样量均为3聽个100聽g。在31聽份阳性样品中，3聽个100聽g聽均验出阪崎肠杆菌的样品很少，绝大多数样品只在3聽个100聽g聽中验出其中1份100聽g聽样品阳性，说明阪崎肠杆菌在乳粉中含量很少，聽如果只取100聽g聽样品进行检测则容易造成漏检。Muytjens聽等发现，来自35聽个国家的141聽种婴儿配方奶粉约14聽%含有阪崎肠杆菌，含量从0.36聽CFU/100聽g聽到66.0聽CFU/100聽g。Nazarowec-White聽和Farber聽测试了加拿大5聽家不同公司的120聽罐婴儿配方奶粉，聽发现其中6.7聽%含有阪崎肠杆菌，阳性样品中阪崎肠杆菌的量通常是0.36聽CFU/100聽g聽所以在检测中取样量一定要充足，定量检测取够333聽g，定性检测取样量为300聽g，才能防止漏检。尤其是成品婴幼儿配方粉检测更应注意，聽虽然Nazarwec-White聽和Farber聽认为1聽000聽个阪崎肠杆菌/100聽g聽为感染限量标准比较合理。而Havelaar和Zwietering聽认为含有低量阪崎肠杆菌的奶粉溶液在

时经两步增菌即可到达105聽CFU/100聽g[4],完全可以达到PCR聽检测要求，聽任何一种DNA聽提取方法均可满足要求，但煮沸法更简单，经济实惠。

3.3聽阪崎肠杆菌阳性统计数据分析

聽聽聽聽阪崎肠杆菌广泛存在于环境和各类食品中，如水、温泉、豆腐、奶酪、咸肉、蔬菜等食品中及医院空气、医疗器械、土壤等环境中[5]。在2005聽年开展阪崎肠杆菌检测方法研究中，从鱼粉、狗咬胶及膨化食品中多次验出阪崎肠杆菌。

聽聽聽聽统计31聽株阪崎肠杆菌的VITEK聽生化鉴定报告，见表3。

聽聽聽聽其中7聽个生化试验结果具有可变性，但与阪崎肠杆菌的检出地域无关。目前核糖核酸分型及质粒分型已应用于阪崎肠杆菌的分型研究中。该生化试验资料的积累为阪崎肠杆菌进一步深化研究及生化分型奠定基础。37聽℃，大约只要2聽h聽就能使超过1/1聽000聽的婴儿患病，因此婴儿配方奶粉中阪崎肠杆菌应该不得检出，要最大限度的防止漏检的发生。

聽

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