1聽范围

本标准规定了食品中阪崎肠杆菌（Enterobacter聽sakazakii）的检验方法。

本标准适用于婴幼儿配方食品、乳和乳制品及其原料中阪崎肠杆菌的检验。

2聽设备和材料

除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：

2.1聽恒温培养箱：25聽℃±1聽℃，36聽℃±1聽℃，44聽℃±0.5聽℃。

2.2聽冰箱：2聽℃～5聽℃。

2.3聽恒温水浴箱：44聽℃±0.5聽℃。

2.4聽天平：感量0.1聽g。

2.5聽均质器。

2.6聽振荡器。

2.7聽无菌吸管：1聽mL（具0.01聽mL聽刻度）、10聽mL（具0.1聽mL聽刻度）或微量移液器及吸头。

2.8聽无菌锥形瓶：容量100聽mL、200聽mL、2000聽mL。

2.9聽无菌培养皿：直径90聽mm。

2.10聽pH聽计或pH聽比色管或精密pH聽试纸。

2.11聽全自动微生物生化鉴定系统。

3聽培养基和试剂

3.1聽缓冲蛋白胨水（buffer聽peptone聽water，BPW）：见附录A聽中A.1。

3.2聽改良月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤-万古霉素（modified聽lauryl聽sulfate聽tryptose聽broth-vancomycin

medium，mLST-Vm）：见附录A聽中A.2。

3.3聽阪崎肠杆菌显色培养基。

3.4聽胰蛋白胨大豆琼脂（trypticase聽soy聽agar，TSA）：见附录A聽中A.3。

3.5聽生化鉴定试剂盒。

3.6聽氧化酶试剂：见附录A聽中A.4。

3.7聽L-赖氨酸脱羧酶培养基：见附录A聽中A.5。

3.8聽L-鸟氨酸脱羧酶培养基：见附录A聽中A.6。

3.9聽L-精氨酸双水解酶培养基：见附录A聽中A.7。

3.10聽糖类发酵培养基：见附录A聽中A.8。

3.11聽西蒙氏柠檬酸盐培养基：见附录A聽中A.9。

第一法阪崎肠杆菌的检验

4聽检验程序

阪崎肠杆菌检验程序见图1。

聽

聽

聽

5聽操作步骤

5.1聽前增菌和增菌

取检样100聽g（mL）加入已预热至44聽℃装有900聽mL聽缓冲蛋白胨水的锥形瓶中，用手缓缓地摇动至充分溶解，36聽℃±1聽℃培养18聽h±2聽h。移取1聽mL聽转种于10聽mL聽mLST-Vm聽肉汤，44聽℃±0.5聽℃培养24聽h±2h。

5.2聽分离

5.2.1聽轻轻混匀mLST-Vm聽肉汤培养物，各取增菌培养物1聽环，分别划线接种于两个阪崎肠杆菌显色培养基平板，36聽℃±1聽℃培养24聽h±2聽h。

5.2.2聽挑取1聽个～5聽个可疑菌落，划线接种于TSA聽平板。25聽℃±1聽℃培养48聽h±4聽h。

5.3聽鉴定

自TSA聽平板上直接挑取黄色可疑菌落，进行生化鉴定。阪崎肠杆菌的主要生化特征见表1。可选择生化鉴定试剂盒或全自动微生物生化鉴定系统。

第二法聽阪崎肠杆菌的计数

7聽操作步骤

7.1聽样品的稀释

7.1.1聽固体和半固体样品：无菌称取样品100聽g、10聽g、1聽g聽各三份，加入已预热至44聽℃分别盛有900聽mL、90聽mL、9聽mL聽BPW聽中，轻轻振摇使充分溶解，制成1:10聽样品匀液，置36聽℃±1聽℃培养18聽h±2聽h。分别移取1聽mL聽转种于10聽mL聽mLST-Vm聽肉汤，44聽℃±0.5聽℃培养24聽h±2聽h。

7.1.2聽液体样品：以无菌吸管分别取样品100聽mL、10聽mL、1聽mL聽各三份，加入已预热至44聽℃分别盛有900聽mL、90聽mL、9聽mL聽BPW聽中，轻轻振摇使充分混匀，制成1:10聽样品匀液，置36聽℃±1聽℃培养18h±2h。分别移取1聽mL聽转种于10聽mL聽mLST-Vm聽肉汤，44聽℃±0.5聽℃培养24聽h±2聽h。

7.2聽分离、鉴定

同5.2，5.3。

8聽结果与报告

综合菌落形态、生化特征，根据证实为阪崎肠杆菌的阳性管数，查MPN聽检索表，报告每100聽g（mL）样品中阪崎肠杆菌的MPN聽值（见附录Ｂ中表B.1）

附录A

（规范性附录）

培养基和试剂

A.1聽缓冲蛋白胨水（BPW）

A.1.1聽成分

蛋白胨聽10.0g

氯化钠聽5.0聽g

磷酸氢二钠（Na2HPO4·12H2O）聽9.0聽g

磷酸二氢钾聽1.5聽g

蒸馏水聽1聽000聽mL

pH聽7.2

A.1.2聽制法

加热搅拌至溶解,调节pH，121聽℃高压灭菌15聽min。

A.2聽改良月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤-万古霉素（Modified聽lauryl聽sulfate聽tryptose聽broth-vancomycinmedium，mLST-Vm）

A.2.1聽改良月桂基硫酸盐胰蛋白胨（mLST）肉汤

A.2.1.1聽成分

氯化钠聽34.0聽g

胰蛋白胨聽20.0聽g

乳糖聽5.0聽g

磷酸二氢钾聽2.75聽g

磷酸氢二钾聽2.75聽g

十二烷基硫酸钠聽0.1聽g

蒸馏水聽1聽000聽mL

pH聽6.8±0.2

A.2.1.2聽制法

加热搅拌至溶解，调节聽pH。分装每管10聽mL，121聽℃高压灭菌15聽min。

A.2.2聽万古霉素溶液

A.2.2.1聽成分

万古霉素聽10.0聽mg

蒸馏水聽10.0聽mL

A.2.2.2聽制法

10.0聽mg聽万古霉素溶解于10.0聽mL聽蒸馏水，过滤除菌。万古霉素溶液可以在0聽℃～5聽℃保存15聽天。

A.2.3聽改良月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤-万古霉素（Modified聽lauryl聽sulfate聽tryptose聽broth-vancomycinmedium，mLST-Vm）

每聽10聽mL聽mLST聽加入万古霉素溶液0.1聽mL，混合液中万古霉素的终浓度为10聽μg/聽mL。

注：mLST-Vm聽必须在24聽h聽之内使用。

A.3聽胰蛋白胨大豆琼脂（TSA）

A.3.1聽成分

胰蛋白胨聽15.0聽g

植物蛋白胨聽5.0聽g

氯化钠聽5.0聽g

琼脂聽15.0聽g

蒸馏水聽1聽000聽mL

pH聽7.3±0.2

A.3.2聽制法

加热搅拌至溶解，煮沸聽1聽min，调节pH，121聽℃高压15聽min。

A.4聽氧化酶试剂

A.4.1聽成分

N,N,N',N'-四甲基对苯二胺盐酸盐聽1.0聽g

蒸馏水聽100聽mL

A.4.2聽制法

少量新鲜配制，于冰箱内避光保存，在聽7聽d聽之内使用。

A.4.3聽试验方法

用玻璃棒或一次性接种针挑取单个特征性菌落，涂布在氧化酶试剂湿润的滤纸平板上。如果滤纸在10聽s聽之内未变为紫红色、紫色或深蓝色，则为氧化酶试验阴性，否则即为氧化酶实验阳性。

注：实验中切勿使用镍/铬材料。

A.5聽L-赖氨酸脱羧酶培养基

A.5.1聽成分

L-赖氨酸盐酸盐（L-lysine聽monohydrochloride）聽5.0聽g

酵母浸膏聽3.0聽g

葡萄糖聽1.0聽g

溴甲酚紫聽0.015聽g

蒸馏水聽1聽000聽mL

pH聽6.8±0.2

A.5.2聽制法

将各成分加热溶解，必要时调节聽pH。每管分装5聽mL，121聽℃高压15聽min。

A.5.3聽实验方法

挑取培养物接种于聽L-赖氨酸脱羧酶培养基，刚好在液体培养基的液面下。30聽℃±1聽℃培养24聽h±2聽h，观察结果。L-赖氨酸脱羧酶试验阳性者，培养基呈紫色，阴性者为黄色。

A.6聽L-鸟氨酸脱羧酶培养基

A.6.1聽成分

L-鸟氨酸盐酸盐（L-ornithine聽monohydrochloride）聽5.0聽g

酵母浸膏聽3.0聽g

葡萄糖聽1.0聽g

溴甲酚紫聽0.015聽g

蒸馏水聽1聽000聽mL

pH聽6.8±0.2

A.6.2聽制法

将各成分加热溶解，必要时调节聽pH。每管分装5聽mL。121聽℃高压15聽min。

A.6.3聽实验方法

挑取培养物接种于聽L-鸟氨酸脱羧酶培养基，刚好在液体培养基的液面下。30聽℃±1聽℃培养24聽h±2聽h，观察结果。L-鸟氨酸脱羧酶试验阳性者，培养基呈紫色，阴性者为黄色。

A.7聽L-精氨酸双水解酶培养基

A.7.1聽成分

L-精氨酸盐酸盐（L-arginine聽monohydrochloride）聽5.0聽g

酵母浸膏聽3.0聽g

葡萄糖聽1.0聽g

溴甲酚紫聽0.015聽g

蒸馏水聽1聽000聽mL

pH聽6.8±0.2

A.7.2聽制法

将各成分加热溶解，必要时调节聽pH。每管分装5聽mL。121聽℃高压15聽min。

A.7.3聽实验方法

挑取培养物接种于聽L-精氨酸脱羧酶培养基，刚好在液体培养基的液面下。30聽℃±1聽℃培养24聽h±2聽h，观察结果。L-精氨酸脱羧酶试验阳性者，培养基呈紫色，阴性者为黄色。

A.8聽糖类发酵培养基

A.8.1聽基础培养基

A.8.1.1聽成分

酪蛋白（酶消化）聽10.0聽g

氯化钠聽5.0聽g

酚红聽0.02聽g

蒸馏水聽1聽000聽mL

pH聽6.8±0.2

A.8.1.2聽制法

将各成分加热溶解，必要时调节聽pH。每管分装5聽mL。121聽℃高压15聽min。

A.8.2聽糖类溶液（D-山梨醇、L-鼠李糖、D-蔗糖、D-蜜二糖、苦杏仁甙）

A.8.2.1聽成分

糖聽8.0聽g

蒸馏水聽100聽mL

A.8.2.2聽制法

分别称取聽D-山梨醇、L-鼠李糖、D-蔗糖、D-蜜二糖、苦杏仁甙等糖类成分各8聽g，溶于100聽mL聽蒸馏水中，过滤除菌，制成80聽mg/mL聽的糖类溶液。

A.8.3聽完全培养基

A.8.3.1聽成分

基础培养基聽875聽mL

糖类溶液聽125聽mL

A.8.3.2聽制法

无菌操作，将每种糖类溶液加入基础培养基，混匀；分装到无菌试管中，每管聽10聽mL。

A.8.4聽实验方法

挑取培养物接种于各种糖类发酵培养基，刚好在液体培养基的液面下。30聽℃±1聽℃培养24聽h±2聽h，观察结果。糖类发酵试验阳性者，培养基呈黄色，阴性者为红色。

A.9聽西蒙氏柠檬酸盐培养基

A.9.1聽成分

柠檬酸钠聽2.0聽g

氯化钠聽5.0聽g

磷酸氢二钾聽1.0聽g

磷酸二氢铵聽1.0聽g

硫酸镁聽0.2聽g

溴百里香酚蓝聽0.08聽g

琼脂聽8.0聽g～18.0聽g

蒸馏水聽1聽000聽mL

pH聽6.8±0.2

A.9.2聽制法

将各成分加热溶解，必要时调节聽pH。每管分装10聽mL，121聽℃高压15聽min，制成斜面。

A.9.3聽实验方法

挑取培养物接种于整个培养基斜面，36聽℃±1聽℃培养24聽h±2聽h，观察结果。阳性者培养基变为蓝色。

附录B

（规范性附录）

阪崎肠杆菌最可能数（MPN）检索表

B.1聽阪崎肠杆菌最可能数（MPN）检索表

每100聽g（mL）检样中阪崎肠杆菌最可能数（MPN）的检索见表B.1。

聽

上一篇：食品微生物学检验 双歧杆菌的鉴定

下一篇：微生物标本送检知多少