操作步骤

样品处理:

聽聽冷冻样品应在45℃以下不超过15聽min或在2℃～8℃不超过18聽h解冻。若不能及时检验，应放于-15℃左右保存；

聽聽非冷冻而易腐的样品应尽可能及时检验。若不能及时检验，应置于2℃～8℃冰箱保存，在24聽h内检验。

样品制备

聽聽以无菌操作取样品25聽g（mL），加入PBS聽225聽mL，用旋转刀片式均质器以8000聽r/min～10000聽r/min均质1聽min～2聽min，或拍击式均质器拍击2聽min。如无均质器，则将样品放入无菌乳钵中磨碎，然后称取25聽g（mL）置合适的容器中，加225聽mL聽PBS，充分振荡混匀。制成1:10的样品匀液。

增菌

聽聽取1：10的样品匀液10聽mL（液体样品可以选择原液），加入90聽mL胰酪胨大豆多粘菌素肉汤中，于30聽℃±1聽℃培养24聽h±2聽h。

分离

聽聽取胰酪胨大豆多粘菌素增菌液划线接种于MYP琼脂平板上。于30聽℃±1聽℃培养24聽h～48聽h。观察平板上生长的菌落。在MYP琼脂平板上，典型菌落为灰白色至微粉红色，周围有白色至淡粉红色沉淀环。

纯培养

聽聽从每个平板选取至少5个典型或可疑菌落，划线接种于营养琼脂平板做纯培养，30聽℃±1聽℃培养24聽h±2聽h，进行确证实验。营养琼脂平板上，典型菌落在为灰白色，偶有黄绿色，不透明，表面粗糙似毛玻璃状或融蜡状，边缘常呈扩展状，直径为4聽mm～10聽mm；

样品的稀释

聽聽聽聽聽吸取1：10的样品匀液1聽mL加到装有9聽mL聽PBS的稀释管中，充分混匀制成1：100的样品匀液。据对样品污染状况的估计，按上述操作，依次制成十倍递增系列稀释样品匀液。每递增稀释1次，换用1支1mL无菌吸管或吸头。

平板计数

聽聽选择2～3个适宜的连续稀释度的样品匀液（液体样品可以选择原液），每个稀释度分别吸取0.1mL接种到MYP琼脂平板上，每稀释度接种两个MYP琼脂平板。用无菌L棒涂布整个平板，注意不要触及平板边缘。使用前，如MYP琼脂平板表面有水珠，可放在25℃聽～聽50℃的培养箱里干燥，直到平板表面的水珠消失。

聽聽涂布后，将平板置于30聽℃±1聽℃培养24聽h±2聽h后（原标准为36聽℃±1聽℃培养12聽h～20聽h）聽，选取具有15个～150个典型或可疑蜡样芽胞杆菌菌落的平板，进行计数。并计算同一稀释度两个平板的平均菌落数。如果菌落不典型，可继续培养18聽h～24聽h再计数。

聽聽计数后，从每个平板选取至少5个已计数的典型或可疑菌落，如果一个平板上少于5个典型或可疑菌落，则取所有典型或可疑菌落，分别划线接种于营养琼脂平板，聽30聽℃±1聽℃培养24聽h±2聽h，进行确证实验。

聽聽根据确证实验确定为蜡样芽胞杆菌的菌落数，按比例计算出该平板上蜡样芽胞杆菌菌落数，然后计算同一稀释度两个平板的平均蜡样芽胞杆菌数，再乘其稀释倍数，再乘以10，即得每g（mL）样品中蜡样芽胞杆菌数并作出报告。

聽

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