嗜热脂肪芽孢杆菌抑制法

原理：

聽聽培养基预先混合嗜热脂肪芽孢杆菌芽孢，并含有聽pH聽指示剂（溴甲酚紫）。加入样品并温浴后，若该样品中不含有抗生素或抗生素的浓度低于检测限，细菌芽孢将在培养基中生长并利用糖产酸，pH聽指示剂的紫色变为黄色。相反，如果样品中含有高于检测限的抗生素，则细菌芽孢不会生长，pH聽指示剂的颜色保持不变，仍为紫色。

检验程序：

聽聽芽孢悬液：将嗜热脂肪芽孢杆菌菌种划线移种于营养琼脂平板表面，56聽℃培养聽24聽h聽后挑取乳白色半透明圆形特征菌落，在营养琼脂平板上再次划线培养，56聽℃培养24聽h聽后转入聽36聽℃培养聽3聽d～4聽d，镜检芽孢产率达到聽95%以上时进行芽孢悬液的制备。每聽块平板用聽1聽mL～3聽mL无菌磷酸盐缓冲液洗脱培养基表面的菌苔（如果使用克氏瓶，每瓶使用无菌磷酸盐缓冲液聽10聽mL～20聽mL）。将洗脱液聽5聽000聽r/min离心聽15聽min。取沉淀物加无菌0.03聽mol/L聽磷酸盐缓冲液（pH聽7.2）制成聽10聽９聽cfu/mL聽芽孢悬液，置聽80聽℃恒温水浴中聽10聽min聽后，密封防止水分蒸发，置冰箱保存备用。

聽聽测试培养基：在溴甲酚紫葡萄糖蛋白胨培养基中加入适量芽孢悬液，混合均匀，使最终的芽孢浓度为聽8×10聽５聽～2×10聽６聽cfu/mL。混合芽孢悬液的溴甲酚紫葡萄糖蛋白胨培养基分装小试管，每管聽200聽μL，密封防止水分蒸发。这样配制好的测试培养基可以在冰箱保存聽6聽个月。

聽聽培养操作：吸聽取样品100聽μL加入含有芽孢的测试培养基中，轻聽轻旋转试管混匀。每聽份检样作二份，另外再作阴性和阳性对照各一份，阳性对照管为聽100聽μL聽青霉素聽G聽参照溶液，阴性对照管为聽100聽μL聽无抗生素的脱脂乳。于聽65℃水浴培养聽2.5聽h，观察培养基颜色的变化。如果颜色没有变化，须再于水浴中培养聽30聽min聽作最终观察。

聽聽判断方法：在白色背景前从侧面和底部观察小试管内培养基颜色。保持培养基原有的紫色为阳性结果，培养基变成黄色或黄绿色为阴性结果，颜色处于二者之间，为可疑结果。对于可疑结果应继续培养30聽min聽再进行最终观察。如果培养基颜色仍然处于黄色－紫色之间，表示抗生素浓度接近方法的最低检出限，此时建议重新检测一次。

报告:

最终观察时，培养基依然保持原有的紫色，可以报告为抗生素残留阳性。

培养基变为呈黄色或黄绿色时，可以报告为抗生素残留阴性。

本方法检测几种常见抗生素的最低检出限为：青霉素3聽μg/L，链霉素聽50聽μg/L，庆大霉素聽30聽μg/L，卡那霉素聽50聽μg/L。

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