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培养基和试剂

A.1磷酸盐缓冲液（PBS）

A.1.2制法

贮存液：称取34.0 g的磷酸二氢钾溶于500 mL蒸馏水中，用大约175 mL的1mol/L氢氧化钠溶液调节pH至7.2，用蒸馏水稀释至1000 mL后贮存于冰箱。

稀释液：取贮存液1.25 mL，用蒸馏水稀释至1000 mL，分装于适宜容器中，121℃高压灭菌15 min。

A.2甘露醇卵黄多黏菌素(MYP)琼脂

A.2.2制法

将A.2.1前五种成分加入于950mL蒸馏水中，加热溶解，校正pH至7.3±0.1，加入酚红溶液。分装，每瓶95mL，121℃高压灭菌15 min。临用时加热溶化琼脂，冷却至50℃，每瓶加入50%卵黄液5 mL和浓度为10000 IU的多黏菌素B溶液1 mL，混匀后倾注平板。

A.2.2.1 50％卵黄液

取鲜鸡蛋，用硬刷将蛋壳彻底洗净，沥干，于70%酒精溶液中浸泡30 min。用无菌操作取出卵黄，加入等量灭菌生理盐水，混匀后备用。

A.2.2.2多黏菌素B溶液

在50 mL灭菌蒸馏水中溶解500000 IU的无菌硫酸盐多黏菌素B。

A.3胰酪胨大豆多黏菌素肉汤

A.3.2制法

将A.3.1前五种成分加入于蒸馏水中，加热溶解，校正pH至7.3±0.2，121℃高压灭菌15 min。临用时加入多黏菌素B溶液混匀即可。多黏菌素B溶液制法同附录A.2.2.2。

A.4营养琼脂

A.4.2制法

将A.4.1所述成分溶解于蒸馏水内，校正pH至7.2±0.2，加热使琼脂溶化。121℃高压灭菌15 min，备用。

A.5过氧化氢溶液

A.5.1试剂

3%过氧化氢溶液：临用时配制，用H2O2配制。

A.5.2试验方法

用细玻璃棒或一次性接种针挑取单个菌落,置于洁净试管内，滴加3%过氧化氢溶液2mL，观察结果。

A.5.3结果于30s内发生气泡者为阳性，不发生气泡者为阴性。

A.6动力培养基

A.6.2制法

将A.6.1所述成分于蒸馏水，校正pH至7.2±0.2，加热溶解。分装每管2 mL～3 mL。115℃高压灭菌20min，备用。

A.6.3试验方法

用接种针挑取培养物穿刺接种于动力培养基中，30℃±1℃培养48 h±2 h。蜡样芽胞杆菌应沿穿刺线呈扩散生长，而蕈状芽胞杆菌常常呈绒毛状生长，形成蜂巢状扩散。动力试验也可用悬滴法检查。蜡样芽胞杆菌和苏云金芽胞杆菌通常运动极为活泼，而炭疽杆菌则不运动。

A.7硝酸盐肉汤

A.7.2制法

将A.7.1所述成分溶解于蒸馏水。校正pH至7.4，分装每管5 mL，121℃高压灭菌15 min。

A.7.3硝酸盐还原试剂

甲液：将对氨基苯磺酸0.8 g溶解于2.5 mol/L乙酸溶液100 mL中。

乙液：将甲萘胺0.5 g溶解于2.5 mol/L乙酸溶液100 mL中。

A.7.4试验方法

接种后在36℃±1℃培养24 h～72 h。加甲液和乙液各1滴，观察结果，阳性反应立即或数分钟内显红色。如为阴性，可再加入锌粉少许，如出现红色，表示硝酸盐未被还原，为阴性。反之，则表示硝酸盐已被还原，为阳性。

A.8酪蛋白琼脂

A.8.2制法

除溴麝香草酚蓝溶液外，将A.8.1所述各成分溶于蒸馏水中加热溶解（酪蛋白不会溶解）。校正pH至7.4±0.2，加入溴麝香草酚蓝溶液，121℃高压灭菌15 min后倾注平板。

A.8.3试验方法

用接种环挑取可疑菌落，点种于酪蛋白琼脂培养基上，36℃±1℃培养48 h±2h，阳性反应菌落周围培养基应出现澄清透明区(表示产生酪蛋白酶)。阴性反应时应继续培养72 h再观察。

A.9硫酸锰营养琼脂培养基

A.9.2制法

将A.9.1所述成分溶解于蒸馏水。校正pH至7.2±0.2。121℃高压灭菌15 min，备用。

A.10聽0.5%碱性复红

A.10.1成分

碱性复红0.5g

乙醇20.0 mL

蒸馏水80.0 mL

A.10.2制法

取碱性复红0.5g溶解于20mL乙醇中，再用蒸馏水稀释至100mL，滤纸过滤后储存备用。

11动力培养基

A.11.1成分

蛋白胨10.0 g

牛肉浸粉3.0g

琼脂4.0g

A.11.2制法

将A.11.1所述成分溶解于蒸馏水。校正pH至7.2±0.2，分装小试管，121℃高压灭菌15 min，备用。

A.12糖发酵管

12.2制法

A.12.2.1糖发酵管按A.12.1所述成分配好后，校正pH至7.2±0.2，按0.5 %加入葡萄糖，分装于一个有倒置小管的小试管内，115℃高压灭菌15 min。

A.12.2.2其他各种糖发酵管可按A.12.1所述成分配好后，分装每瓶100 mL，115℃高压灭菌15 min。另将各种糖类分别配好10 %溶液，同时115℃高压灭菌15 min。将5 mL糖溶液加入于100 mL培养基内，以无菌操作分装小试管。

注：蔗糖不纯，加热后会自行水解者，应采用过滤法除菌。

A.12.3试验方法

挑取可疑菌落接种于葡萄糖发酵管中，厌氧条件下36℃±1℃培养24 h±2 h。培养基由红色变为黄色者表明该菌在厌氧条件下能发酵葡萄糖。

A.13 V-P培养基

A.13.2制法

将A.13.1所述成分溶解于蒸馏水。校正pH至7.0±0.2，分装每管1 mL。115℃高压灭菌20min，备用。

A.13.3试验方法

用营养琼脂培养物接种于本培养基中，36℃±1℃培养48 h～72 h。加入6 %α-萘酚-乙醇溶液0.5 mL和40 %氢氧化钾溶液0.2 mL，充分振摇试管，观察结果，阳性反应立即或于数分钟内出现红色。如为阴性，应放在36℃±1℃培养4 h再观察。

A.14胰酪胨大豆羊血(TSSB)琼脂

A.14.2制法

将A.14.1所述各成分于蒸馏水中加热溶解。校正pH至7.2±0.2，分装每瓶100 mL。121℃高压灭菌15 min。水浴中冷却至45℃～50℃，毎100mL加入5～10mL无菌脱纤维羊血，混匀后倾注平板。

A.15溶菌酶营养肉汤

A.15.2制法

除溶菌酶溶液外，将A.15.1所述成分溶解于蒸馏水。校正pH至6.8±0.1，分装每瓶99 mL。121℃高压灭菌15 min。每瓶加入0.1 %溶菌酶溶液1 mL，混匀后分装灭菌试管，每管2.5 mL。0.1%溶菌酶溶液配制：在65 mL灭菌的0.1 mol/L盐酸中加入0.1 g溶菌酶，隔水煮沸20 min溶解后，再用灭菌的0.1 mol/L盐酸稀释至100 mL。或者称取0.1 g溶菌酶溶于100 mL的无菌蒸馏水后，用孔径为0.45 μm硝酸纤维膜过滤。使用前测试是否无菌。

A.15.3试验方法

用接种环取纯菌悬液一环，接种于溶菌酶肉汤中，36℃±1℃培养24 h。蜡样芽胞杆菌在本培养基(含0.001％溶菌酶)中能生长。如出现阴性反应，应继续培养24 h。

A.16西蒙氏柠檬酸盐培养基

A.16.2制法

除溴麝香草酚蓝溶液和琼脂外，将A.16.1所述各成分溶解于1000.0 mL蒸馏水内，校正pH至6.8，再加琼脂，加热溶化。然后加入溴麝香草酚蓝溶液，混合均匀后分装试管，121℃高压灭菌15 min。制成斜面。

A.16.3试验方法

挑取少量琼脂培养物接种于西蒙氏柠檬酸培养基，36℃±1℃培养4d。每天观察结果，阳性者斜面上有菌落生长，培养基从绿色转为蓝色。

A.17明胶培养基

A.17.1成分

蛋白胨5.0 g

牛肉粉3.0 g

明胶120.0 g

蒸馏水1 000.0 mL

A.17.2制法

将A.17.1所述成分混合，置流动蒸汽灭菌器内，加热溶解，校正pH至7.4～7.6，过滤。分装试管，121℃高压灭菌10 min，备用。

A.17.3试验方法

挑取可疑菌落接种于明胶培养基，36℃±1℃培养24h±2h，取出，2℃～8℃放置30 min，取出，观察明胶液化情况。

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