聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽中华人民共和国进出口商品检验行业标准聽
出口食品小肠结肠炎耶尔森氏菌检验方法聽聽SN聽0174—92聽代替聽ZB聽X04聽003—86
1　主题内容与适用范围
　　本标准规定了出口冷冻和生鲜的猪肉、猪舌、鸡肉、虾和虾仁中小肠结肠炎耶尔森
氏菌(以下简称耶氏菌)检验方法。
　　本标准适用于出口冷冻和生鲜的猪肉、猪舌、鸡肉、虾和虾仁中耶氏菌检验。其他
食品可参照使用。聽
2　样品制备及增菌培养
2.1　如为冷冻食品,应于2～5℃下不超过18h解冻。若不能及时检验,应放于—15℃保存,
最多不能超过2聽d。非冷冻易腐的食品应置于4℃冰箱保存,最多不得超过3d。
2.2　无菌操作称取剪碎后的样品25g(猪舌应剪取舌根、舌两侧及舌尖部肉),置于装有
225mL改良的磷酸盐缓冲液的500mL广口玻璃瓶中,充分振荡(若采用均质,可将剪碎后的
样品25g置于灭菌均质杯内,加入25mL已灭菌的改良磷酸盐缓冲液,以8000～10000r/min
均质0.5min,再将均质好的样品置入装有200mL改良的磷酸盐缓冲液的500mL广口玻璃瓶
中,充分振荡),然后于25℃培养48±2h。吸取该培养液1mL移种于预先预热到25℃的装有
9mL的5g/L氢氧化钾溶液的试管中,使之充分混合0.5min。立即吸取该混合液2mL移种于
预先预热到25℃的装有8聽mL的改良的酵母浸汁-孟加拉红肉汤的试管中,充分混合,于25
℃培养4～6h。
3　分离培养
3.1　将上述经改良的酵母浸汁-孟加拉红肉汤增菌的培养液摇匀,以直径3mm的接种环分
别挑取一环划线于表面无凝固水的含吐温80的亚硫酸铋琼脂平板和含吐温80的麦康凯琼
脂平板各一个,培养于25℃,含吐温80的亚硫酸铋琼脂平板培养3～4d,含吐温80的麦康凯
琼脂平板培养48±2h。
3.2　观察各琼脂平板,有无典型或可疑耶氏菌菌落。
　　耶氏菌的菌落特征见表1：
4聽鉴定
4.1聽筛选试验
4.1.1　每种琼脂平板至少应挑取两个典型或可疑菌落,分别用光滑的接种针穿刺并密布
地接种于改良的克氏双糖铁琼脂各一管,于25℃培养24±2h。聽
4.1.2　挑取菌落后的琼脂平板,应置于5～8℃至少保留24聽h,以备必要时复查。
4.1.3　按表2试验结果进行判断。
4.2　生化试验
4.2.1　刮取一满环(直径3mm)符合表聽2的典型或可疑耶氏菌特性的改良克氏双糖铁琼脂
斜面培养物,接种于装有1mL聽Rustigian氏尿素培养基(改良法)的10聽mm×100聽mm的试管
中,手摇或于电动快速混合器上振摇5～6s,然后于25℃培养,每隔半小时观察一次,培养观
察至4h。
4.2.2　将尿素酶试验阳性的改良克氏双糖铁琼脂斜面培养物按表3所列生化项目(尿素酶
试验除外)进行生化试验,培养于25℃,氨基酸脱羧酶试验培养24～30h,其他生化试验阴
性结果的应培养观察4d。
4.2.3　观察生化反应结果,将符合表3耶氏菌特性的,按4.3进行血清学试验；如不符合
表3聽所列生化反应,特别是尿素酶试验阴性或赖氨酸脱羧酶试验阳性为非小肠结肠炎耶
尔森氏菌。
4.3　血清学试验
　　在洁净的载玻片上加一滴“O”因子血清,将待试培养物混入其内,使成为均一性混
浊悬液,将玻片轻轻摇动0.5～1聽min,在黑色背景下观察反应。如在2min内出现比较明显
的小颗粒状凝集者,即为阳性反应,反之则为阴性,另用生理盐水作对照试验,以检查有无
自凝现象。
4.4　根据4.2和4.3试验结果,按照表3进行判定。
　　如生化反应结果完全符合表3耶氏菌特性,但与所有“O”因子血清均不发生凝集反应
者,其菌落典型,镜检为革兰氏阴性、无芽胞小短杆菌,可按《Bergey氏细菌学鉴定手册》
最新版扩大必要的生化试验,判定为可疑小肠结肠炎耶尔森氏菌,并送交上一级单位鉴定。
5　报告结果聽
5.1　报告阳性结果:“检出小肠结肠炎耶尔森氏菌”。聽
5.2　报告阴性结果:“未检出小肠结肠炎耶尔森氏菌”。聽
6　培养基聽
6.1　改良的磷酸盐缓冲液聽
　　磷酸氢二钠　　　　　　　　　　　　　　　　8.23g
　　磷酸二氢钠(含1个结晶水)　　　　　　　　聽1.20g
氯化钠　　　　　　　　　　　　　　　　　　5.00g
　　山梨醇聽10.00g
　　胆盐(3号)　　　　　　　　　　　　　　　　聽1.50g
　　蒸馏水聽1000mL
　　将前三种成分溶于水中,再加入后两种成分,溶解后调至pH7.6,分装于500mL广口玻
璃瓶内,每瓶225mL,高压灭菌121℃15min。
6.2　改良的酵母浸汁-孟加拉红肉汤(modified聽yeast聽extract-rose聽bengal聽broth)
6.2.1　基础液
　　磷酸二氢钾聽0.508g
　　磷酸氢二钠聽11.21g
　　酵母浸汁　　　　　　　　　　　　　　　　　5.00g
　　氯化钠　　　　　　　　　　　　　　　　　　1.00g
　　硫酸镁(含7个结晶水)　　　　　　　　　聽0.01g
　　蒸馏水聽770mL
　　将上述各成分溶于蒸馏水中,加热使之完全溶解,调至pH8.0,121℃高压灭菌15min。
6.2.2聽40聽g/L山梨糖水溶液：100.00聽mL。
6.2.3聽10聽g/L丙酮酸钠水溶液：100.00mL。
6.2.4　4g/L孟加拉红水溶液：10.00聽mL。
6.2.2,聽6.2.3溶液流通蒸汽加热0.5h灭菌,6.2.4溶液过滤除菌,将灭菌过的此三种
溶液加到灭菌、冷却的基础液中,调至最终pH为8.0,以无菌操作分装于18mm×180mm灭菌
的试管中,每管8mL,4℃冰箱保存备用。
6.3　含吐温80的麦康凯琼脂
　　蛋白胨聽12.00g
　　(月示)蛋白胨(proteose聽peptone)聽3.00g
　　乳糖聽10.00g
　　胆盐(3号)　　　　　　　　　　　　　　聽1.50g
　　氯化钠　　　　　　　　　　　　　　　　5.00g
　　吐温80(Tween聽80)　　　　　　　　　聽　10.00g
　　氯化钙(无水)　　　　　　　　　　　　　0.20g
　　中性红聽0.03g
　　结晶紫聽0.001g
　　琼脂聽18.00g
　　蒸馏水聽1000mL
　　将琼脂于800mL蒸馏水中加热溶化,以50mL蒸馏水将吐温80稀释,再将其他各成分(指
示剂除外)加入150mL蒸馏水中,加热使之完全溶解。将后二种溶液加至已溶化的琼脂液
中,充分混匀,聽调至pH7.1±0.2,再加入指示剂,混匀后121℃高压灭菌15min,待冷至50～
55℃时,立即倾注于灭菌平皿内,每皿约15聽mL,制成的琼脂平板呈淡橙色。
6.4　含吐温80的亚硫酸铋琼脂
6.4.1　基础液
　　牛肉膏　　　　　　　　　　　　　　　　　　　5.00g
　　蛋白胨聽10.00g
　　葡萄糖　　　　　　　　　　　　　　　　　　　5.00g
　　氯化钠　　　　　　　　　　　　　　　　　　　5.00g
吐温8O(Tween聽80)　　　　　　　　　　　　　聽10.00g
　　氯化钙(无水)　　　　　　　　　　　　　　　　0.20g
　　琼脂聽20.00g
　　蒸馏水聽1000mL
6.4.2　亚硫酸铋混合液
6.4.2.1　溶解200聽g无水亚硫酸钠于1000聽mL蒸馏水中,配成200聽g/L水溶液。
6.4.2.2　溶解50聽g枸橼酸铋铵于500聽mL蒸馏水中,配成100g/L水溶液,加1mL浓的氢氧化
铵,放置至澄清,可能还需再加数毫升氢氧化铵。加此溶液于6.4.2.1溶液中并混合之。
6.4.2.3　加100聽g无水磷酸氢二钠并混合之。
6.4.2.4　加10聽g枸橼酸铁铵于100聽mL蒸馏水中,配成100聽g/L水溶液。并将此液加入上
述的6.4.2.1、6.4.2.2、6.4.2.3的混合液中。
　　将混合液于100℃加热2聽min或3聽min,用橡皮塞塞瓶,储存于室温暗处,不可放于冰箱
内。
6.4.3　加70mL亚硫酸铋混合液于1000聽mL经121℃灭菌15min并冷至70℃左右的基础液中,
彻底摇匀,再加4聽mL聽10g/L煌渌水溶液,混匀,待冷至50℃左右时倾注平皿。制成的平板
应为淡乳黄色、不透明,存放于室温暗处或冰箱内,以临用前一天制备为宜。
6.5　改良的克氏双糖铁琼脂
　　牛肉膏　　　　　　　　　　　　　　　　　3.00g
　　酵母膏　　　　　　　　　　　　　　　　　3.00g
　　蛋白胨聽15.00g
　　(月示)蛋白胨　　　　　　　　　　　　　　5.00g
　　山梨醇聽20.00g
　　葡萄糖　　　　　　　　　　　　　　　　　1.00g
　　硫酸亚铁　　　　　　　　　　　　　　　　0.20g
　　氯化钠　　　　　　　　　　　　　　　　　5.00g
　　硫代硫酸钠聽　　　　　　　　　聽0.30g
　　酚红　　　　　　　　　　　　　　　　　聽0.024g
　　琼脂聽15.00g
　　蒸馏水聽1000mL
　聽以800mL蒸馏水将琼脂加热溶化,再用200mL蒸馏水将其他成分(酚红除外)加热溶解,
再将以上两种溶液混匀,调至pH7.4±0.2,然后加入酚红,分装于13mm×130mm试管,121℃
高压灭菌15min,待冷至50℃左右,斜置成深高层斜面。制成的培养基为淡橙红色。
　　培养基采用高层穿刺、斜面密布划线接种法。25℃培养24±2h。观察结果:小肠结肠
炎耶尔森氏菌的反应为底层斜面均产酸、变黄色、无硫化氢、不产气(偶有少量小气泡)。
6.6　Rustigian氏尿素酶试验培养基(改良法)
6.6.1　基础成分
　　酵母浸汁　　　　　　　　　　　　　　　　0.10g
　　磷酸二氢钾　　　　　　　　　　　　　聽　0.091g
　　磷酸氢二钠(无水)　　　　　　　　　　聽　0.095g
　　酚红　　　　　　　　　　　　　　　　　　0.01g
　　蒸馏水聽900mL
　　高压灭菌121℃聽15min
6.6.2聽浓尿素液
尿素聽20.00g
蒸馏水聽100.00g
　　过滤除菌
6.6.3　将上述两液混合,分装于10mm×100mm的灭菌试管中,每管约1聽mL左右。制成的培
养基为淡橙黄色,尿素酶反应阳性者培养基由淡橙黄色变为桃红色,阴性者颜色不变。
6.7　鸟氨酸脱羧酶、赖氨酸脱羧酶试验培养基
6.7.1　基础液
　　蛋白胨　　　　　　　　　　　　　　　　聽5.00g
　　牛肉膏　　　　　　　　　　　　　　　　聽5.00g
　　溴甲酚紫(16聽g/L)　　　　　　　　　聽　0.625mL
　　甲基红　　　　　　　　　　　　　　　　2.50mL
　　葡萄糖　　　　　　　　　　　　　　　聽　0.50g
　　盐酸吡哆素(维生素B6,pyridoxine)聽　　聽0.005g
　　蒸馏水　　　　聽1000mL
　　调至pH6或6.5
6.7.2　基础液分成三等分,第一部分不加任何氨基酸,分装试管作对照用；第二部分按
10g/L加入L-赖氨酸双盐酸盐；第三部分按10g/L加入L-鸟氨酸双盐酸盐。若使用DL氨基
酸,应相应地于培养基中按2％浓度加入。加入氨基酸后应再调pH,然后分别分装于10mm
×100mm试管中,121℃高压灭菌10聽min。
6.7.3　培养基接种后,应加一层液体石蜡(约10mm厚),于25℃培养24～30h。阳性反应者
为紫色或红紫色,弱阳性者为青灰色,阴性反应为黄色。
6.8　糖发酵培养基
6.8.1　糖发酵肉汤基础液
　　蛋白胨　　　　　　　　　聽10.00g
　　牛肉膏　　　　　　　　　　　　　　　　3.00g
　　氯化钠　　　　　　　　　　　　　　　　5.00g
　　Andrade氏指示剂聽10.00g
　　蒸馏水聽1000mL
　　调至pH7.1～7.2
6.8.2　蔗糖、山梨醇最终使用浓度为10g/L,可于灭菌前加入基础液中,分装试管,121℃
高压灭菌10min。L-阿拉伯糖和鼠李糖最终使用浓度为10g/L,应先配成100g/L水溶液,L-
阿拉伯糖水溶液流通蒸汽灭菌30min,鼠李糖水溶液121℃高压灭菌10min,然后分别以无
菌操作加入先经121℃高压灭菌15min的基础液中,无菌操作分装于已灭菌的13mm×130mm
试管中,每管3mL。
6.8.3聽Andrade氏指示剂
　　蒸馏水聽100.0mL
　　酸性复红　　　　　　　　　　　　　　　0.50g
　　氢氧化钠(1.0moL/L)　　　　　　　　　16.00mL
　　将酸性复红溶于蒸馏水中,并加入氢氧化钠,数小时后,如复红褪色不够,再加1聽mL
或2mL氢氧化钠溶液,此试剂如保存时间较长则效果更好。
6.8.4　此培养基制成后近于无色,接种后于25℃培养24±2h,阴性反应应继续培养观察
4d。阳性反应为红色,阴性反应则颜色不变。
6.9　西蒙氏枸橼酸盐琼脂
　　硫酸镁　　　　　　　　　　　　　　　聽0.20g
　　氯化钠　　　　　　　　　　　　　　　　5.00g
磷酸二氢按聽　　　　　　　聽1.00g
　　磷酸氢二钾　　　　　　　　　　　　　　1.00g
　　枸橼酸钠　　　　　　　　　　　　　　　2.00g
　　琼脂聽20.00g
　　蒸馏水聽1000mL
　　加1:500溴麝香草酚蓝指示剂溶液40mL,混匀,分装13mm×130mm试管,每管约4mL。
121℃高压灭菌15聽min。斜置试管使成2.5cm高层和4聽cm长的斜面。
　　制成的培养基为透明、草绿色,接种后于25℃培养24±2h,阴性反应者观察4d。阳性
反应者斜面变为蓝色,阴性反应则颜色不变。
6.10聽5g/L氢氧化钾溶液
6.10.1　标准溶液
　　称取40聽g氢氧化钾,溶于经121℃高压灭菌30聽min的5g/L氯化钠溶液中,使成400g/L
氢氧化钾标准溶液,于4聽℃保存备用。
6.10.2　取1mL400g/L氢氧化钾标准溶液,加入经121℃高压灭菌30聽min的79mL5g/L氯化
钠水溶液中,分装于已灭菌的18mm×180mm试管中,每管9mL,此溶液应用前新鲜配制。
6.11聽“O”因子血清。
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