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一. 目的
聽聽聽 掌握RT-PCR技术的一般原理和操作步骤
二.原理
聽聽聽聽 PCR(聚合酶链式反应)技术是利用从嗜热水生菌(Thermasaquaticus)中提取或经基因重组合成的耐热DNA聚合酶(常用TaqDNAPolymerase)在高温下快速扩增位于两段已知序列之间DNA片段的技术。PCR过程包括：一.DNA模板的变性(94-95℃),二.单链DNA模板与引物的退火(45-55℃)，三.引物的延伸(72℃),这三步经25-30个循环而完成了PCR的全过程 。
三.材料、试剂及仪器
聽聽聽 病毒侵染的植株和健康对照总RNA或病毒RNA，3 ’特异性引物1，5’特异性引物2 ，AMV 反转录酶，5X 反转录buffer ，10mMdNTP，TaqDNAPoiymerase ，10 ×TaqDNAPoiymeraseBuffer(内含50mM/LKCL聽、10mM/LTris.Cl(pH8.3)、1.5mM/LMgCL),ddH2O。聽
液体石蜡，小离心管，移液器，PCR扩增仪。
四.步骤
1．反转录（RT ）
反应体系：
聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽 ddH2O聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽 μl
聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽 5X反转录Buffer聽聽聽聽聽聽聽 10μl
聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽 10mMdNTP聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽 3 μl
聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽 RNasin聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽 40u
聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽 模板RNA聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽 0.1-1 μg
聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽 3’端特异引物聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽 0.1 μg
聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽 AMV反转录酶聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽 10
聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽 总体积聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽 50 μl
反应条件：42℃ 1-2小时。
2．PCR扩增
反应体系：
聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽 ddH2O聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽 μl
聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽 10×PCRbuffer聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽 10μl
聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽 10mMdNTP聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽 0.5 μl
聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽 5’引物(0.1ug/ μl)聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽 1μl
聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽 3’引物(0.1ug/ μl)聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽 1μl
聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽 TaqDNAPolymerase聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽 2-5u
聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽 模板反转录产物聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽 1-5μl
聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽 总体积聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽 50 μl
聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽 石蜡油聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽 70 μl
聽聽聽 反应步骤：
循环变性退火聚合
1聽聽聽 94℃ 5分钟聽聽 55℃ 1分钟聽聽 72℃ 2分钟
2聽聽 聽94℃聽1分钟聽聽 55℃ 1分钟聽聽 72℃ 2分钟
末轮循环聽聽 94℃ 1分钟聽聽 55℃ 1分钟聽聽 72℃ 7分钟
3.聽 电泳检测与分析
聽聽聽 PCR反应完毕，取6-8 μl反应产物于0.8%琼脂糖凝胶电泳检测，选择合适的DNA 分子量标准作对照。
聽
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