【摘要】聽 目的：分析耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌(MRSA)检测方法及其耐药性。方法：采用头孢西丁纸片法和PCR两种方法检测临床分离的60株金黄色葡萄球菌中MRSA菌株;纸片扩散法测定金黄色葡萄球菌对15种抗菌药物的敏感性。结果：纸片法及PCR法对MRSA检出率分别为15%、13.3%,两种方法对MRSA检出率差异无统计学意义（P＜0.05）。以PCR法检出mecA、femB基因为判断MRSA的金标准。除了替考拉宁、万古霉素以外,其余抗生素的耐药率MRSA组均明显高于MSSA组(P<0.01)。结论：头孢西丁纸片法是筛选和确认MRSA菌株的一种可靠、简便的方法;MRSA为多重耐药菌株,临床应加强检测。

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【关键词】聽 耐甲氧西林;金黄色葡萄球菌,R4/E3C

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　　Study on insecticide tolerance of Methicillin resistant Staphylococcus aureus

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　　FANG Qiang

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　　Department of Bioengineering, Changchun Industry University, Changchun 130012, China

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聽聽聽 Abstract: Objective聽 To analyze differentiate of detecting Methicillin resistant Staphy lococeus aureus ( MRSA) and investigate the changes of antimicrobial susceptibility of staphylococcus aureus in order to guide a reasonable use of antibiotics. Methods聽 Sixty strains of S. aureus isolated from clinical specimens were tested for K-B to 15 antibiotics. Results聽聽 The isolate rate of K-B and PCR method was 15% and 13.3%,respectively, which there was not significant difference (P>0.05). The double-PCR was goaden criterion for MRSA. Except for Vancomyem and Teicoplanin , the susceptiblility of MRSA was lower than MSSA. Conclusion聽聽聽 K-B for Cefoxitin is a reliable and convenient method. Surveillance of the susceptibility of provincial S. aureus to antimicrobial agents is of great importance to both rational use of antibiotics and reduction of resistant strains.

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聽聽聽 Key Words：Staphylococcus aureus; Susceptibility; Antimicrobial agents

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聽聽聽 耐甲氧西林金黄色葡萄球菌目前已经成为院内感染的主要病原菌，并逐渐扩展到社区，与艾滋病、病毒性乙型肝炎并列成为世界三大感染性疾病，严重威胁着人类的健康。及时准确的检测MRSA，并合理应用抗菌素，采取严格的隔离和消毒措施，对于控制MRSA院内暴发流行，限制向社区蔓延是十分必要的。

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　　1聽聽 材料与方法

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　　1.1聽 菌株来源：为我研究中心收集的2005 年1 月～2005 年12 月吉林省人民医院60 例住院患者各种细菌标本。MRSA 医院感染的诊断按《临床医院感染学》确定［1 ］ 。质控菌株金黄色葡萄球菌ATCC25923、ATCC29213 均购自卫生部临床检验中心。

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　　1.2聽 抗生素纸片及培养基：抗生素纸片均购自北京天坛药物生物技术公司;血琼脂、巧克力琼脂等平板购自天津赛凌科技服务有限公司;药敏试验的M - H 琼脂平板由杭州天和微生物试剂有限公司提供的M - H 琼脂粉按说明要求溶解、灭菌、配制。

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　　1.3聽 细菌鉴定：细菌的分离和培养按《全国临床检验操作规程》(第2版) 进行;细菌鉴定采用法国生物梅里埃API staph 鉴定系统和手工法。

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　　1.4聽 MRSA株的检测(采用K-B法)：在M-H琼脂中加入2%～4%NaCl溶液,35℃,培养24h,采用较稳定的头孢西丁纸片代替甲氧西林,如金黄色葡萄球菌的抑菌环≤19mm,判定为MRSA株。

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　　1.5聽 mecA～femB双重PCR体系及扩增条件［2］：94℃预变性4min，94℃变性45s，50℃退火45s，72℃延伸60s，进行30次循环，最后72℃延伸2min，反应结束后，将PCR产物于4℃保存。mecA和femB基因扩增引物见表1，参照JonasD［3］等报道设计，由上海生物工程有限公司合成。表1聽 PCR扩增mecA和femB基因所用引物（略）

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　　1.6聽 药敏试验：采用K-B法,其操作及结果判定按照美国国家临床实验室标准委员会(NCCLS)颁布的规则(2000年版)进行［1］。

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　　2聽 结果

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　　2.1聽 K-B法检测MRSA：60株金黄色葡萄球菌通过K-B法检测MRSA，结果有9株为MRSA，51株为MSSA。

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　　2.2聽 MRSA确证试验：mecA～femB双重PCR对K-B法检测的9株MRSA进行确证试验，其中8株为MRSA，另一株为mecA阴性，femB阳性，为MSSA。表2聽 mecA、femB基因在不同种类葡萄球菌中的表达（略） 注：MRSA－苯唑西林耐药的金黄色葡萄球菌；MSSA－苯唑西林敏感的金黄色葡萄球菌；MRSCoN－苯唑西林耐药的凝固酶阴性葡萄球菌；MSSCoN－苯唑西林敏感的凝固酶阴性葡萄球菌

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　　2.3聽 对8株MRSA进行药敏试验：结果如表3。表3聽 8株MRSA的耐药情况（略）注：M：100bp DNA ladder marker；1：MRSA阳性对照株（协和医院细菌室提供）的PCR扩增产物；2：MSSA（ATCC25923）的PCR扩增产物；3-13：MRSA株的PCR扩增产物。

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　　3聽 讨论

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聽聽聽 对MRSA的检测，除检验科常用、快速的纸片扩散法外，根据文献报道（原理见表2），还需要进行mecA～femB双重PCR确证试验。本研究对K-B检测的9株菌再次进行确证试验，结果发现其中1株为MSSA。

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聽聽聽 MRSA的分离率与不同时期、不同地域及抗生素选择压力不同等多种因素有关，但总体来说，呈缓慢上升趋势。本研究调查的5家教学医院中，MRSA平均分离率为53.9％，高于李家泰［4］于2000年～2001年对我国13家医院监测的平均分离率（37.4％）。其中上海中山医院MRSA分离率最高（79.5％），这与2004年汪复［5］教授等人对上海地区14家医院监测的结果63.9％（56.0％～86.5％）接近；武汉最低（31.6％）；浙江与武汉接近，为35％，基本接近张绍银［6］报道的结果（43.2％）。

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聽聽聽 另外，MRSA的危害性更严重的表现在对多种药物的多重耐药性，特别是β－内酰胺酶阳性的菌株，其耐药频率更高。表1中可以看出，MRSA对许多抗生素包括青霉素G、头孢类、大环内酯类、四环素类、单一抗生素类的庆大霉素、克林霉素等均表现为大于90％耐药，对于常用抗生素利福平也有不同程度的耐药，即使体外药敏敏感，但治疗效果不理想。唯独万古霉素、替考拉宁对其有100％敏感。MSSA对青霉素也有90％以上耐药，对红霉素和克林霉素的敏感率也已经降低至30％～60％，对奎诺酮类抗菌药物的敏感率已经低于90％，对头孢类抗菌药物还保持90％左右的敏感。由此可见，如果长期大量的滥用抗菌药物，即使是MSSA，耐药谱也会逐渐扩大。所有金黄色葡萄球菌对万古霉素和替考拉宁仍表现为100％敏感。目前，万古霉素是治疗MRSA感染的首选药物。但是，一旦大量使用万古霉素，又有潜在的耐万古霉素菌株出现的可能。自2002年美国报道了第1株耐万古霉素的金黄色葡萄球菌以来，先后出现3株VRSA［7］。我国尚无耐万古霉素金葡菌的报道。如万古霉素对MRSA治疗无效，那么后果不堪设想。

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聽聽聽 总之，快速、准确的检测MRSA，及时监测耐药谱，对发生MRSA暴发流行的控制，知道临床实践具有重要意义。

作者：房强聽聽聽 作者单位：长春工业大学生物工程学院，吉林 长春 130012

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【参考文献】

聽 　　［1］山东省卫生厅.医院感染管理手册［M］.济南:山东科学技术出版社,2000：53-69.

　　［2］Daum RS, Ito T, Hiramatsu K, et al. A novel Methicillin resistance cassette in community acquired Methicillin resistant Staphylococcus aureus isolates of diverse genetic backgrounds［J］. J Infect Dis，2002，186:134.

　　［3］Berger Bachi B. Expression of resistance to methicillin［J］. Trends Microbiol, 1994,2:389.

　　［4］李家泰，李 耘，王 进.中国医院和社区获得性感染革兰阳性球菌耐药性监测研究［J］.中华医学杂志，2003，83（5）：365.

　　［5］德 妹，汪 复，张婴元.2004年上海地区细菌耐药性监测［J］.中国抗感染化疗杂志，2005，5（4）：195.

　　［6］张绍银.846株金葡菌中耐甲氧西林葡萄球菌的分离结果及耐药性分析［J］.实用医学杂志，2005，21（3）：257.

　　［7］Fred C，Tenover，McDonald LC. Vancomycin－resistant staphylococci and enterococci：epidemiology and control［J］.Curr Opin Infect Dis,2005,18：300.