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      杆状病毒滴度检测



      录入时间:2010-5-26 15:54:35 来源:易生物

      实验目的:检测病毒滴度
      实验原理:根据噬菌斑数计算病毒滴度
      材料与试剂:
      1、6孔板,12ml离心管,100ml无菌玻璃瓶,无菌吸管,70℃水浴锅,无菌水
      2、杆状病毒, SF9:5×105cells/ml
      3、4% agarose gel:2g agrose + 50ml 水,高压灭菌
      4、2×Grace(unsupplemented):9.14g粉末(invitrogen)+0.07gNaHCO3+H2O,调PH6.1,定容至100ml,无菌过滤
      5、supplemented Grace:1×Grace添加3.33mg/ml Lactalbumin,3.33mg/ml yeastolate,无菌过滤
      6、高温灭活FBS
      方法:
      1、无菌条件下,2ml/孔细胞(5×105cells/ml)种入6孔板,室温孵育1h使其贴壁,孵育后镜检其贴壁程度
      2、将4% agarose gel放入70℃水浴锅融解,空100ml无菌瓶与2×Grace放入40℃水浴锅预热
      3、将杆状病毒用无血清supplemented Grace梯度稀释:10-1~10-8
      4、弃6孔板内上清,快速加入稀释好的病毒,1ml/孔,复孔,室温孵育1h
      6、配置上层琼脂:加20ml高温灭活FBS到2×Grace 100ml,25ml 2×Grace(含FBS)+12.5ml 无菌水+12.5ml 4% agarose gel,至预热的100ml无菌瓶,轻轻混匀,放入37℃水浴锅备用
      7、弃6孔板内上清,快速加2ml上层琼脂,以防菌层干燥,静置10-20min使其凝固
      8、将6孔板放入27℃培养箱,培养4-10天
      9、计数板中噬菌斑,直至连续两天无变化,加1mg/ml中性红0.5ml,室温孵育2h后计数噬菌斑
      注:
      病毒滴度(pfu/ml)=1/稀释倍数×噬菌斑数×1/每孔接种体积

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