聽氢氧化钠溶液
二乙烯基苯基－N－乙烯基吡咯烷酮共聚物小柱（200聽mg）：在内径聽12～13聽mm聚乙烯管中装填200mg二乙烯基苯基－N－乙烯基吡咯烷酮共聚物或具有同等分离特性的物质。
七氟丁酸：聽七氟正丁酸
苯硫氨酯标准品：含苯硫氨酯99%以上，熔点为129℃～130℃。
苯硫苯咪唑标准品：含苯硫苯咪唑98%以上，熔点为233℃（分解）。

4．试验溶液的配制

1)聽提取方法
称取5.0g搅碎混合均匀的样品，加入30mL乙腈、20mL乙腈饱和正己烷和10g无水硫酸钠均质后，以每分钟3,000转离心分离5分钟。乙腈层和正己烷层移入分液漏斗中，收集乙腈层。正己烷层加入离心分离的残留物中，再加入20mL乙腈，激烈振荡混合后，以每分钟3,000转离心分离5分钟。舍弃正己烷层，将乙腈层合并于前面的乙腈层中，加入10聽mL正丙醇，40℃以下浓缩，除去溶剂。
2)聽砜化
将1)所得的残留物溶解于0.5聽mL无水乙酸后，加入0.5聽mL过氧化氢混合，室温下放置30分钟。加入5聽mL聽1聽mol/L聽亚硫酸钠溶液混合，室温下放置10分钟后，加入10聽mL聽1聽mol/L聽氢氧化钠溶液。
3)聽净化方法
在二乙烯基苯基－聽N－乙烯基吡咯烷酮共聚物小柱（200聽mg）中顺次注入10m聽L甲醇、10mL水，舍弃流出液。柱中注入2)所得的溶液后，注入10mL水，舍弃流出液。注入10mL甲醇，溶出液在40℃以下浓缩，除去溶剂。残留物中加入1聽mL甲醇溶解，作为试验溶液。

5．标准曲线的制作

苯硫氨酯试验时，将苯硫氨酯标准品配制成聽0.05～50聽mg/L聽的甲醇溶液数点。奥芬达唑、奥芬达唑砜和苯硫苯咪唑试验时，将苯硫苯咪唑标准品配制成0.05～50聽mg/L聽的甲醇溶液数点。将1聽mL各标准品的甲醇溶液在40℃以下浓缩，除去溶剂。残留物按照与4．试验溶液的制备中2)砜化和3)净化方法相同操作，分别注入HPLC聽中，用峰高法或峰面积法绘制成标准曲线。

6．定量试验

注入试验溶液于HPLC中，按照5．的标准曲线分别求得苯硫氨酯和苯硫苯咪唑的含量，按下式求得奥芬达唑砜的含量。
奥芬达唑砜的含量＝（苯硫氨酯的含量×聽0.74）＋（苯硫苯咪唑的含量×聽1.11）

7．测定条件

1)聽苯硫氨酯试验
①聽HPLC
检测器：聽UV聽或DAD（波长聽280聽nm聽附近的最大波长）
柱：十八烷基甲硅烷基化硅胶（粒径聽2～5聽碌m），内径2.0～6.0聽mm，长100～250聽mm。
柱温：聽40℃
流动相：聽乙腈：0.005聽mol/L七氟丁酸溶液（2:3）的混合溶液
保留时间标准：聽7～10聽分钟
②聽LC/MS
柱：十八烷基甲硅烷基化硅胶（粒径聽2～5聽碌m），内径2.0～6.0聽mm，长100～250聽mm。
柱温：40℃
流动相：乙腈：0.005聽mol/L七氟丁酸溶液（2:3）的混合溶液。
主离子聽(聽m/z)：聽ESI+聽479
保留时间标准：聽7～10聽分钟
2)聽奥芬达唑、奥芬达唑砜和苯硫苯咪唑试验
①聽HPLC
检测器：聽UV聽或DAD（波长聽290聽nm附近的最大波长）
柱：十八烷基甲硅烷基化硅胶（粒径聽2～5聽碌m），内径2.0～6.0聽mm，长100～250聽mm。
柱温：聽40℃
流动相：乙腈：0.005聽mol/L七氟丁酸溶液（3:7）的混合溶液。
②聽LC/MS
柱：十八烷基甲硅烷基化硅胶（粒径聽2～5聽碌m），内径2.0～6.0聽mm，长100～250聽mm。
柱温：聽40℃
流动相：乙腈：0.005聽mol/L七氟丁酸溶液（3:7）的混合溶液。
主离子聽(聽m/z)：聽ESI+聽332
保留时间标准：聽7～10聽分钟

8．定量限

0.01聽mg/kg（奥芬达唑，奥芬达唑砜，苯硫氨酯和苯硫苯咪唑中分别以奥芬达唑砜计）

9．注意事项

1)检测方法概述
本方法用乙腈从样品中提取奥芬达唑，奥芬达唑砜，苯硫氨酯和苯硫苯咪唑，乙腈／正己烷分配脱脂后，用无水乙酸和30%过氧化氢将苯硫氨酯氧化成砜体、苯硫苯咪唑和奥芬达唑氧化为奥芬达唑砜，HPLC(UV聽或DAD)分别测定，LC/MS确证。
2)聽注意点
①聽因无水乙酸、30%过氧化氢、亚硫酸钠的反应性高，操作中要小心。此外，因这些试剂经常容易变化，保管时要小心。
②聽对于砜化，加入1聽mol/L聽亚硫酸钠溶液和1聽mol/L聽氢氧化钠溶液时，因激烈发热要小心。
③聽确认砜化结束，根据需要用HPLC和LC/MS测定奥芬达唑，苯硫氨酯和苯硫苯咪唑。
作为各测定条件的例子：使用内径聽3.0聽mm，长150聽mm聽的柱时，
奥芬达唑：流动相：乙腈：0.05%三氟乙酸（1:4）的混合溶液，流速：0.4聽mL/min，UV聽测定波长：290聽nm，MS聽测定离子：聽ESI+聽316聽(聽m/z)，保留时间：聽8聽分钟。
苯硫氨酯：流动相：乙腈：0.05%三氟乙酸（1:1）的混合溶液，流速：0.4聽mL/min，UV测定波长：280聽nm，MS测定离子：聽ESI+聽447聽(聽m/z)，保留时间：约11聽分钟。
苯硫苯咪唑：流动相：乙腈：0.05%三氟乙酸（2:3）的混合溶液，流速：0.4聽mL/min，UV测定波长：290聽nm，MS聽测定离子：聽ESI+聽300聽(聽m/z)，保留时间：约5分钟。
其他的测定条件按照7．测定条件的进行。
④聽在二乙烯基苯基－N－乙烯基吡咯烷酮共聚物小柱（200聽mg）中注入砜化所得的溶液时，如残留过氧化氢，小柱中会分解产生气泡，使溶液流出不一致。此时，加压吸引强制流出。

聽

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