五、RNA技术操作
聽 聽1. 在MS平板上铺上已灭菌的玻璃纸，接种适量的孢子悬液，涂布均匀，30度培养适当时间，刮取菌丝体,在预冷的碾钵中加入液氮碾磨2~3次。收集粉末状菌丝体小半勺于1.5 ml的指型管中。加入250 ul的悬浮缓冲液混匀置于冰上。
聽聽 2*.收集液体培养物(洗过的), 加入溶菌酶溶液（溶菌酶的终浓度为2 mg/ml，用P Buffer稀释）使终体积250 ul。 于30度水浴15 min(原生质体刚开始形成)。
聽聽 3. 加入70 ul EDTA(0.25M) , 混匀。
聽聽 4. 加入375 ul的裂解缓冲液充分混匀，溶液呈清亮状。
聽聽 5. 加入等体积的热酚, 用手震荡混匀, 于65度水浴5 min。 (a.水饱和酚应提前于65度加热, 高温下, 酚的溶解度加大。b. RNA在碱性环境中易分解。)
聽聽 6. 13,000 rpm离心5 min, 取上清。 (室温下, 酚仍有少量与水混溶, 因而上清为乳白色。)
聽聽 7. 再次加入等体积的热酚, 震荡混匀,聽 于65度水浴5 min. 13,000 rpm离心5 min, 取上清。
聽聽 8. 加入等体积酚/氯仿(1:1), 震荡混匀, 13,000 rpm离心5 min, 取上清。
聽聽 9. 加入等体积的氯仿, 震荡混匀, 13,000 rpm离心5 min, 取上清。 (一定要充分震荡, 以除尽残余的酚, 否则, 酚会对后续实验造成不良影响。)
聽聽 10.加入1/5体积的LiCl(10M), 两倍体积的无水乙醇, 混匀, 于-20度放置2 hr。
11.于4度, 13,000 rpm, 30 min, 有白色沉淀。
12.用80%的冰乙醇洗两次（在冰上进行），以将盐离子去除干净。
13.冷冻真空干燥。
14.溶于适当的DEPC处理过的水中，于-70度保藏。
聽
注：1. 所有的枪头、指型管均需用DEPC(0.1%)（Takara）水处理。DEPC为油状，不溶于水，应充分搅拌，使其均匀分散。
聽聽聽 2. 所有操作必须戴上手套，而且手套要经常换。
聽聽聽 聽聽3. 水饱和酚： 将重蒸酚适量装于一密闭瓶中，加入酚的1/2体积的去离子水，混匀，于65℃温浴，使酚充分溶解于水。
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链霉菌的RT-PCR（promega RT kit）
聽聽 反转录：1. 反应体系（50 ul）
聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽 模板（去除了DNA的RNA）聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽 * ul
聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽 引物（可以只是下游引物）（50 pmol/ul）聽聽 1 ul聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽
聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽 dNTP (10 mM)聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽 1 ul聽
聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽 MgSO4聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽 2 ul
聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽 5* buffer聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽 10 ul
聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽 AMV聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽 1 ul
聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽 H2O聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽 聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽至50 ul
聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽 2. 反应程序：
聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽 模板、引物和水混合后60(或65)度保温4 min（保证mRNA的强二级结构完全打开），取出置于冰上再加入其他成分（避免AMV高温失活）。
聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽 48℃聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽 45 min
聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽 95℃聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽 2 min
聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽 4 ℃聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽 5 min
聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽 产物于-20℃保藏。
反转录产物可不经纯化直接用于常规PCR扩增。
聽
注：1. 引物设计见常规PCR扩增。但要保证引物之间不会有干扰。
2. 模板中的DNA要去除干净，做好阴性对照。（即以RNA为模板进行相同的反应。）
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