聽聽聽
聽聽聽化妆品微生物标准检验方法金黄色葡萄球菌及注解
中华人民共和国国家标准
化妆品微生物标准检验方法金黄色葡萄球菌聽UDC聽668：576聽.85.07
(GB7918.5－87)
Standard聽methods聽of聽microbiological聽examination聽for聽cosmetics
Staphylococcus聽aureus
金黄色葡萄球菌在外界分布较广，抵抗力也较强能引起人体局部化脓性病灶，严重时可导致败血症，因此化妆品中检验金黄色葡萄球菌有重要意义。
1聽方法提要
根据本菌特有的形态及培养物质性，应用Baird聽Parker平板进行分离，该平板中的氯化锂可抑制革兰氏阴性细菌生长，丙酮酸钠可刺激金黄色葡萄球菌生长，以提高检出率，并利用分解甘露醇和血浆凝固酶等特征，以兹鉴别。
2聽培养基和试剂
2.1聽培养基
2.1.1聽SCDLP液体培养基
见GB聽7918.1聽-聽87《化妆品微生物标准检验方法聽总则》。
2.1.2聽7.5％的氯化钠肉汤
成分：蛋白胨聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽10g
牛肉膏聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽3g
氯化钠聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽75g
蒸馏水聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽1000ml
制法：将上述成分加热溶解，调pH为7.4，分装，121℃(15聽1b)15min高压灭菌。
2.1.3聽Baerd聽Parker聽平板
成分：聽胰蛋白胨聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽10g
牛肉膏聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽5g
酵母浸膏聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽1g
丙酮酸钠聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽10g
甘氨酸聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽12g
氯化锂(LiCl·6H2O)聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽5g
琼脂聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽20g
蒸馏水聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽950ml
聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽pH7.0±0.2
增菌剂的配制：30％卵黄盐水50ml与除菌过滤的1％亚碲酸钾溶液10ml&127;混合，保存于冰箱内。
制法：将各成分到蒸馏水中，加热煮沸完全溶解，冷至25℃校正pH。分装每瓶95ml，121℃高压灭菌15min。临用时加热溶化琼脂，每95ml加入预热到50℃的卵黄亚碲酸钾增菌剂5ml，摇匀后倾注平板。培养基应是致密不透明的。使用前在冰箱储存不得超过48h。
2.1.4聽血琼脂培养基
成分：营养琼脂聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽100ml
脱纤维羊血(或兔血)聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽10ml
制法：将营养琼脂加热溶化，待冷至50℃左右以无菌手续加入脱纤维羊血，摇匀，制成平板，置冰箱内备用。
2.1.5聽甘露醇发酵培养基
成分：聽蛋白胨聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽10g
氯化钠聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽5g
甘露醇聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽10g
牛肉膏聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽5g
0.2％溴麝香草酚蓝溶液聽聽聽聽聽聽聽聽聽12ml
蒸馏水聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽聽1000ml
制法：聽将蛋白胨、氯化钠、牛肉膏加到蒸馏水中，加热溶解，调pH7.4，加入甘露醇和指示剂，混匀后分装试管中，115℃(10聽1b)20min灭菌备用。
2.1.6聽兔(人)血浆制备
取3.8％柠檬酸钠溶液〔121℃(15聽1b)30min灭菌〕1份加兔(人)全血4份，混匀静置，2000～3000r/min离心3～5min。血球下沉，取上面血浆。
3聽设备和材料
3.1聽显微镜。
3.2聽培养箱。
3.3聽离心要。
3.4聽灭菌吸管：1ml，5ml，10ml。
3.5聽灭菌试管。
3.6聽载玻片。
3.7聽酒精灯。
4聽操作步骤
4.1聽增菌：取1：10稀释的样品10ml接种到90mlSCDLP液体培养基中(如无此培养基也可用7.5％氯化钠肉汤)，置37℃培养箱，聽培养24h。(1)
注：如无此培养基也可用7.5％氯化钠肉汤，检验含防腐剂的化妆品时，可在聽1000ml此培养基中加1g卵磷脂、7g吐温80。
4.2聽分离：自上述增菌培养液中，取1～2接种环，划线接种在Baird聽Parker氏培养基，如无此培养基也可划线接种到血琼脂平板，置37℃培养24～48。在血琼脂平板上菌落呈金黄色，大而突起，圆形，不透明，表面光滑，周围有溶血圈。在Baird聽Parker聽氏培养基上为圆形，光滑，凸起，湿润，直径为2～3mm，颜色呈灰色到黑色，边缘为淡色，周围为一混浊带，在其外层有一透明带。用接种针接触菌落似有奶油树胶的软度。偶然会遇到非脂肪溶解的类似菌落，但无混浊带及透明带。挑取单个菌落分纯在血琼脂平板上，置37℃培养24H。
4.3聽染色镜检：挑取分纯菌落，涂片，进行革兰氏染色，镜检。金黄色葡萄球菌为革兰氏阳性菌，排列成葡萄状，无芽胞，无夹膜，致病性葡萄球菌，菌体较小，直径约为0.5～1μm。
4.4聽甘露醇发酵试验：取述分纯菌落接种到甘露醇发酵培养基中，置37℃培养24h，金黄色葡萄球菌应能发酵甘露醇产酸。
4.5聽血浆凝固酶试验
4.5.1聽玻片法：取清洁干燥载玻片，一端滴加一滴灭菌生理盐水，另一端滴加一滴血浆，用接种环挑取待检菌落，分别在生理盐水及血浆中充分研磨混合。血浆与菌苔混悬液在5min内出现团块或颗粒状凝块时，而盐水滴仍呈均匀混浊无凝固现象者为阳性，如两者均无凝固现象则为阴性。凡玻片试验呈阴性反应或盐水滴与血浆滴均有凝固现象，再进行试管凝固酶试验。
4.5.2聽试管法：吸取1：4新鲜血浆0.5ml，放入灭菌小试管中，再加入待检菌24h肉汤培养物0.5ml。混匀，放37℃温箱或水浴中，每半小时观察一次，24h之内如呈现凝块即为阳性。同时以已知血浆凝固酶阳性和阴性菌株肉汤培养物及肉汤培养基各0.5ml聽1：4血浆混匀，做为对照。
5聽检验结果报告
凡在上述选择平板上有可疑菌落生长，经染色镜检，证明为革兰氏阳性葡萄球菌，并能发酵甘露醇产酸。血浆凝固酶试验阳性者，可报告被检样品检出金黄色葡萄球菌。
附加说明：
本标准由中国预防医学科学院环境卫生监测所归口。
本标准由“化妆品微生物标准检验方法”起草小组起草。
本标准主要起草人刘以贤。
本标准由中国预防医学科学院环境卫生监测所负责解释
注解:
（1）增菌培养
本标准方法用SCDLP增菌液增菌，其成分中含有中和剂，抑菌效果较差，杂菌生长较多。在增菌培养基中加适量的亚碲酸钾（钠），当金黄色葡萄球菌生长时可将其还原，变为黑色，使培养液增加碱性；亚碲酸钾（钠）并可与蛋白胨中含硫氨基酸结合，形成的亚碲酸与硫的复合物，有抗细菌硫源代谢作用，因而可抑制其他细菌生长繁殖。
（2）分离培养
分离金黄色葡萄球菌的培养基有（Vogel-Johnson琼脂、Baird聽Parker琼脂、血琼脂、卵黄高盐琼脂、TMP琼脂等、CTFA、FDA和日本的方法均用Vogel-Johson琼脂培养基。我国食品微生物标准检验方法规定Baird聽Parker琼脂和血琼脂培养基。Vogel-Johnson琼脂和Baird-Parker琼脂的基本成分类似。为尊重传统习惯用法，在化妆品标准检验方法中只选用Baird-Parker和血琼脂二种培养基。现将各分离鉴别培养基的主要成分，作用机制和注意事项介绍如下：
1）聽Baird-Parker和Vogel-Johnson琼脂培养基中的氯化钾可抑制革兰氏阴性菌生长，丙酮酸钠可刺激金黄色葡萄球菌生长，以提高检出率。
2）血琼脂不仅适应金黄色葡萄球菌的生长，菌落较大，颜色鲜明，而且有鉴别溶血反应的作用，可作为血凝固酶试验的补充，增加致病菌株的检出机会。
3）卵黄高盐琼脂、氯化钠用量较大，渗透压高，有抑制某些细菌的生长作用。卵黄中的卵磷脂，有促进金黄色葡萄球菌的生长发育和鉴别的作用。该菌的卵磷脂酶可分解卵磷脂，因而生长的典型菌落，表面周围有月晕状油膜，底部有乳浊圈，易于鉴别，本培养基抑菌作用较小，杂菌生长较多。
表4金葡萄球菌的菌落特征
培养基
聽菌落特征
聽
Baird-Parker琼脂
聽圆形隆起，光滑，直径为2～3mm，呈灰色到黑色，边缘色淡，周围为一混浊带，外层有一透明带。
聽
血琼脂
聽金黄色，圆形隆起，边缘整齐，外周有透明的深血环，直径为1～2mm。
聽
卵黄高盐
聽金黄色，圆形隆起，边缘整齐，直径为1～2mm，外周有卵磷脂被分解的乳浊圈。
聽
TMP琼脂
聽金黄色，圆形隆起，边缘整齐，直径0.7～1mm,周围有黄色环。
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4）TMP琼脂：加有适量亚碲酸钾，多量氯化钠以及甘露醇和酚红指示剂，抑制杂菌的作用较强，应适当加大接种量，取3～5环增菌液划线。金黄色葡萄球菌可还原亚碲酸钾使之变黑，并可发酵甘露醇产酸，使指示剂变黄，以致菌落呈墨黑色，周围有黄色环，容易鉴别。亚碲酸钾的用量应注意准确，因其抑菌力较强，对金黄色葡萄球菌的生长也有一定影响，因而菌落较小。
（3）糖发酵试验：多数葡萄球菌菌株分解葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、产酸不产气，致病性葡萄球菌在厌氧条件下分解甘露醇、产酸，非致病性葡萄球菌无此作用。
（4）血浆凝固酶试验
试管法是检测葡萄球菌的胞外游离血浆凝固酶（作用于凝固酶原）。
玻片法是检测结合血浆凝固酶（作用于纤维蛋白原）。此法快速、简便，大多数中间型葡萄球菌和猪葡萄球菌呈阴性反应。金黄色葡萄球菌中有10～15％可呈阴性反应。
有学者推荐乳胶凝集试验作为快速及常规检验方法。将1:8稀释的乳胶、悬液与等量人血浆（用EDTA处理后，经甘氨酸。盐酸缓冲液作1:1000稀释）混合制成乳胶制剂。试验时将待检菌置于加盐水的玻片上，再加一滴乳胶试剂，混匀观察结果，凝集则为血浆凝固酶阳性。本法的准确如同试管法。
（5）检验报告
1）按常规程序检验，凡分离出革兰氏阳性葡萄球菌的疑似菌落，经证实可发酵甘露醇、血浆凝固酶阳性的菌株，可报告检出金黄色葡萄球菌。
2）如果分离的疑似菌落不发酵甘露醇，但血浆凝固酶阳性也可断定为检出金黄色萄葡球菌。
3）分离出的葡萄球菌疑似菌落，不发酵甘露醇、血浆凝固醇阴性，判断未检出金黄色葡萄球菌。

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