聽聽聽
聽聽聽1　主题内容与适用范围
　　本标准规定了产气荚膜梭菌的检验方法。
　　本标准适用于食品和食物中毒样品中产气荚膜梭菌的检验。
　　2　引用标准
　　GB聽4789.28　食品卫生微生物学检验染色法、培养基和试剂
　　3　设备和材料
　　3.1　均质器。
　　3.2　显微镜。
　　3.3　温箱：36±1℃。
　　3.4　水浴。
　　3.5　厌氧培养装置：常温催化除氧式或碱性焦性没石子酸除氧式。
　　3.6　吸管：1mL，10mL。
　　3.7　试管。
　　3.8　平皿。
　　3.9　接种环或接种针。
　　4　培养基和试剂
　　4.1　庖肉培养基：GB聽4789.28中4.67。
　　4.2　亚硫酸盐－多粘菌素－磺胺嘧啶琼脂(SPS)：GB聽4789.28中4.69。
　　4.3　液体硫乙醇酸盐培养基(FT)：GB聽4789.28中4.70。
　　4.4　动力－硝酸盐培养基：GB聽4789.28中4.72。
　　4.5　含铁牛奶培养基：GB聽4789.28中4.71。
　　4.6　卵黄琼脂培养基：GB聽4789.28中4.68。
　　4.7　0.1%蛋白胨水稀释剂：GB聽4789.28中4.86。
　　4.8　硝酸盐还原试剂：GB聽4789.28中3.17。
　　4.9　革兰氏染色液：GB聽4789.28中2.2。
　　5　检验程序
　　产气荚膜梭菌检验程序如下：
　　（图略）
　　6　操作步骤
　　6.1　活菌计数培养
　　6.1.1　按无菌操作称取食品检样25g(mL)放入均质器，加0.1%蛋白陈水稀释剂225mL，低速搅动1～2min，使之均质化，作为1∶10稀释液。
　　6.1.2　以上述1∶10稀释的均质液按1mL加0.1%蛋白陈稀释剂9mL做成10-2～10-6的系列稀释液。
　　6.1.3　吸取各稀释液1mL分别放入2个灭菌平皿内。每个平皿浇注约50℃的SPS琼脂15～20mL，仔细转动平皿，使稀释液和琼脂充分混匀。
　　6.1.4　上述琼脂平板凝固后，倒置于厌氧培养装置内，于36±1℃培养24h。
　　6.1.5　选取长有30～300个黑色菌落的平板，计数黑色菌落数。
　　6.2　确证试验
　　6.2.1　由平板上任取10个黑色菌落，分别按种FT培养基，于36±1℃培养18～24h。
　　6.2.2　用上述培养液涂片，革兰氏染色镜检。产气荚膜梭菌为革兰氏阳性粗大杆菌，其耐热株可能形成卵形芽孢，位于菌体中央或近端，其宽度一般不大于菌体。
　　6.2.3　用接种环(针)穿刺接种动力－硝酸盐培养基，于36±1℃培养24h，观察接种线的生长情况，判断有无动力。然后，滴加甲萘胺液和对氨基苯磺酸液各0.5mL，观察硝酸盐是否被还原。产气荚膜梭菌无动力，能将硝酸盐还原为亚硝酸盐。
　　6.2.4　取生长旺盛的FT培养液1mL接种于含铁牛乳培养基，在46℃水浴中培养2h后观察有无“暴烈发酵”现象，5h内不发酵者为阴性。产气荚膜梭菌发酵乳糖，凝固酪蛋白并大量产气，呈“暴烈发酵”现象，但培养基不变黑。
　　6.2.5　用接种环取FT培养液点种于卵黄琼脂平板(每张平板至少可接种10点)，于36±1℃厌氧培养24h，观察接种点的变化。产气荚膜梭菌产生卵磷脂酶，分解卵黄中的卵磷脂，接种点的底部及周围形成乳白色的混浊带。
　　6.3　菌数计算
　　根据黑色菌落的计数(6.1.5)和确证试验的结果(6.2)，计算每克(毫升)食品检样的含菌数。　　
　　例如：10-4稀释液的平板长有黑色菌落100个，而供做确证试验的10个菌落中有7个被确证为产气荚膜梭菌，则每克(毫升)食品检样所含产气荚膜梭菌数为：
　　100×0.7×104＝7×105
　　附加说明：
　　本标准由卫生部卫生监督司提出。
　　本标准由卫生部兰州生物制品研究所负责起草。
　　本标准主要起草人王成怀。
　　本标准由卫生部委托技术归口单位卫生部食品卫生监督检验所负责解释。

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